Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Summary

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Abstract

Cardiomiócitos neonatais cultivadas têm sido muito utilizados para estudar myofibrillogenesis e funções miofibrilares. Cardiomiócitos cultivados permitir a fácil manipulação e investigação das vias bioquímicas, e seu efeito sobre as propriedades biomecânicas do batimento espontâneo cardiomiócitos.

O protocolo de 2 dias a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Mostramos como dissecar facilmente corações de recém-nascidos, dissociar o tecido cardíaco e enriquecer cardiomiócitos a partir da população de células cardíacas. Discute-se o uso de diferentes misturas de enzimas para a célula-dissociação, e seus efeitos sobre células-viabilidade. Os cardiomiócitos isolado pode ser posteriormente utilizado para uma variedade de,, ensaios com células-biológica ou bioquímica biomecânico electrofisiológicos morfológicas. Nós otimizamos o protocolo para a robustez e reprodutibilidade, usando soluções só comercialmente disponíveis e enzima mistura que show variabilidade pouco de lote para lote. Nós também tratar de problemas comuns associados com o isolamento e cultura de cardiomiócitos, e oferecem uma variedade de opções para a otimização das condições de isolamento e de cultura.

Introduction

Os primeiros relatórios para a dissociação de sucesso e cultura de células cardíacas de roedores remonta à década de 1960 ^1,2. Mesmo então, Harary e Farley notado que os cardiomiócitos cultivados "pode ​​fornecer um sistema único para o estudo dos requisitos da contractilidade periódica [, e podem] fornecem um meio para determinar a contribuição de diversas vias metabólicas para a [bater] processo". Embora Harary e Farley cardiomiócitos isolados e cultivados de ratos jovens, bem como o protocolo original foi adaptado e modificado por muitos cientistas ao longo dos anos, o procedimento de isolamento e cultura geral não mudou muito. No entanto, os melhores enzimas ^3, soluções padronizadas ^{de 4,5,} e a adição do canal reversível e miosina ATPase BDM para proteger as células durante o procedimento de isolamento de ^6-9 melhorou significativamente célula-produtividade e viabilidade.

Adulto miocardiopatia vs neonatalcitos

Cardiomiócitos isoladas e cultivadas a partir de murganhos ou ratos recém-nascidos têm várias vantagens sobre as culturas de cardiomiócitos adultos. Em primeiro lugar, o procedimento de isolamento para neonatais do rato ou do rato corações é mais fácil e menos dispendiosa, quando comparada com o isolamento de cardiomiócitos de rato ou um rato adulto ^10. Cardiomiócitos neonatais são muito menos sensíveis a reintrodução de um meio contendo cálcio após dissociação, aumentando consideravelmente o rendimento celular. Outra grande vantagem é que os cardiomiócitos neonatais do mouse passar por uma desdiferenciação mais rápida – ciclo rediferenciaï que normalmente resulta em bater espontaneamente células 20 horas após o plaqueamento, enquanto cardiomiócitos adultos normalmente exigem estimulação para induzir contração. Cardiomiócitos neonatais também são mais facilmente transfectable com os métodos de transfecção lipossomal, enquanto cardiomiócitos adultos necessitam de vetores virais para a entrega bem sucedida de DNA transgênico. Em contraste com cardiomiócitos neonataiss, a cultura de cardiomiócitos de roedores adultos ^11-13 permite investigações de degradação miofibrilar e eventual restabelecimento do aparelho contrátil. Estas alterações morfológicas características em cardiomiócitos adultos ocorrem em períodos de 1-2 semanas. A desdiferenciação – ciclo rediferenciaï é acompanhado por reexpressão do programa gene fetal, imitando assim alterações patológicas observadas em cardiomiopatias humanos ^14. Outra vantagem de cardiomiócitos de rato adulto durante a cultura de cardiomiócitos neonatais é a capacidade de cultura destas células por longos períodos de tempo.

Rato vs cardiomiócitos de rato

O isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos recém-nascidos tem algumas vantagens sobre o de cardiomiócitos neonatais rato, incluindo rendimentos mais elevados de células viáveis ​​e aumento das taxas de transfecção. No entanto, a ampla utilização de modelos de ratos geneticamente modificados para doenças cardíacas (por exemplo, </ Em> a lim muscular rato knockout proteína como modelo para cardiomiopatia dilatada ¹⁵⁾ levou à adaptação do procedimento de isolamento de cardiomiócitos derivados de camundongos recém-nascidos. Embora os protocolos usados ​​para isolar neonatais cardiomiócitos de ratos e camundongos são quase idênticas, maior cuidado deve ser tomado na seleção de uma mistura de enzimas apropriadas para o último. Com efeito, os cardiomiócitos neonatais de rato são geralmente mais susceptíveis a overdigestion, resultando numa redução de rendimento celular e viabilidade. Além disso, a densidade do revestimento deve ser ajustado, por cardiomiócitos derivados de ratinhos neonatais são um tanto menor em comparação com células derivadas a partir de corações de ratos recém-nascidos.

Com muitos usos para a investigação de parâmetros morfológicos, eletrofisiológicos, bioquímicos, celulares e biológicos e biomecânicos, bem como para o processo de myofibrillogenesis, cardiomiócitos neonatais cultivadas tornaram-se um dos sistemas mais versáteis para o estudo dafunções das células cardíacas in vitro. O primeiro passo para um ensaio bem sucedido no entanto, depende de uma metodologia simples e de confiança para isolar cardiomiócitos neonatais de rato. Nosso protocolo tira a sua metodologia de muitas fontes e foi otimizada para a reprodutibilidade e robustez. Discutimos fatores que influenciam cardiomiócitos-rendimento e viabilidade, e fornecer uma variedade de opções para a otimização de condições de isolamento e de cultura.

Protocol

O seguinte procedimento descreve um protocolo de 16,17 de dois dias para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais de rato. Todas as soluções são estéreis ou esterilizadas por filtração. Todas as ferramentas são esterilizados por esterilização da superfície com etanol a 75%. Exceto para a extração do tecido inicial, todas as etapas são realizadas em uma cultura de células de fluxo laminar capô estéril. Este protocolo destina-se ao isolamento de corações neonatais de rato 1-2 ninhad…

Representative Results

Usando este protocolo, foram isoladas a partir de 8 corações um dia de idade ratos neonatal (Figuras 1A, 1B, Suplementar filme S1). Após a lavagem e picagem dos corações com a tesoura (Figuras 1C-1F), fragmentos de tecido foram pré-digeridas em meio de isolamento durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Após a pré-digestão (Figura 1G), transferimos os fragmentos de tecidos em meio de digestão acabado de fazer, e incubou-se os fragmentos de tecido durante…

Discussion

O uso de modelos animais para estudar doenças cardíacas se tornou padrão na pesquisa cardiovascular. Mais perto caracterização bioquímica desses modelos (ou seja, estudando as respostas diretas de células cardíacas a estímulos bioquímicos ou biomecânicos) normalmente requer o isolamento de tecidos cardíacos ou cardiomiócitos. Estudos que investigam as respostas fisiológicas do coração ex vivo (por exemplo, a acetilcolina ^40, ou em cenários de isquemia-reperfusão ^41)</s…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.