Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d'études livraison Gene

Summary

L'implantation de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine peut servir de modèle préclinique utile pour évaluer de nouvelles thérapies. Des cellules de carcinome de la vessie MB49 peuvent être cultivées à l'intérieur de la vessie après l'instillation intravésicale. Ce protocole illustre le cathétérisme de la vessie de la souris dans le but d'implantation de la tumeur et la livraison adénoviral.

Abstract

cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l'appareil génito-urinaire et de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent réduire la récidive et la progression sont nécessaires. Le micro-environnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement de la tumeur et la réponse thérapeutique. Il est donc souvent souhaitable de cultiver les cellules tumorales dans les organes dont ils sont issus. Ce protocole décrit un modèle orthotopique de cancer de la vessie, dans laquelle les cellules de carcinome de la vessie murin MB49 sont instillées dans la vessie par l'intermédiaire d'un cathétérisme. Implantation réussie de cellules tumorales dans ce modèle nécessite la rupture de la couche de glycosaminoglycane protectrice, qui peut être réalisé par des moyens physiques ou chimiques. Dans notre protocole de la vessie est traitée avec de la trypsine avant l'instillation de la cellule. Le cathétérisme de la vessie peut également être utilisé pour délivrer la thérapeutique une fois que les tumeurs sont établies. Ce protocole décrit la fourniture d'un produit de construction adenoviral qui exprime un gène rapporteur de la luciférase. Alors que our protocole a été optimisé pour les études à court terme et se concentre sur la livraison de gènes, la méthodologie de la souris cathétérisme de la vessie a de larges applications.

Introduction

cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l'appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas et 15 000 décès attendus en 2012 ^1. Les taux élevés de récidive exigent vie suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l'un des cancers les plus coûteuses à traiter. Cancer de la vessie qui a envahi la couche musculaire peut se métastaser dans le foie, le poumon ou l'os par l'intermédiaire du système lymphatique. Thérapie multimodale de tumeurs avancées résultats en seulement 20-40% de survie après 5 ans. Par conséquent, les stratégies de traitement efficaces visant à réduire la récidive et de progression du cancer superficiel de la vessie ainsi que l'amélioration des résultats thérapeutiques chez les patients ayant une maladie avancée sont nécessaires d'urgence.

Développement de nouveaux produits thérapeutiques nécessite des modèles précliniques pour évaluer l'efficacité suite à l'évaluation initiale in vitro. Le microenvironnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement du cancer et la réactivité, ce qui souligne la nécessité d'précliniquemodèles al dans lequel les tumeurs surviennent ou peuvent être établis dans l'organe d'origine. Une approche est le développement de modèles transgéniques dans lesquels les tumeurs apparaissent spontanément ou peut être induite de manière spécifique à un organe. Un excellent protocole d'un modèle de cancer de la vessie transgénique a été récemment publiée ^2. L'inconvénient de modèles transgéniques est que les tumeurs ont tendance à se développer lentement et avec moins d'uniformité que souhaité. En outre, le coût de l'entretien d'une colonie d'élevage doit être considérée. Une alternative aux modèles transgéniques est implantation orthotopique de cellules tumorales, ce qui a l'avantage de courts délais de mise en place de la tumeur chez des souris disponibles dans le commerce. Alors que certaines lignées de cellules de cancer de la vessie humaines peuvent être cultivées de manière orthotopique (nous avons utilisé avec succès UM-UC-3), il peut être souhaitable d'établir des tumeurs chez des souris immunocompétentes. Deux lignées cellulaires de cancer de la vessie murin orthotopique, qui se développent sont MBT-2 et ³ MB49. Depuis MBT-2 cellules sont contaminés par la réplicationrétrovirus de type C ^4, nous avons choisi cellules MB49 pour nos études. Il est important de noter que MB49 cellules ont été isolées à partir d'une souris mâle et orthotopique implantations sont effectuées pour des raisons anatomiques chez des souris femelles. Ceci a l'avantage de faciliter l'identification des cellules implantées par marqueurs du chromosome Y, mais la disparité entre les sexes peut être un inconvénient pour les études immunologiques.

L'épithélium de la vessie est bordée par une (GAG) couche de glycosaminoglycanes, qui fonctionne comme une barrière à l'infection par des microorganismes. Cette barrière peut également interférer avec l'implantation des cellules tumorales et plusieurs méthodes ont été développées pour surmonter cette difficulté (tableau 1). Bistouri électrique a été largement utilisé comme un moyen physique pour perturber la couche de GAG ^5-13 et une électrocoagulation démontrant de protocole a été récemment publié dans JoVE ^14. Toutefois, si une unité d'électrocoagulation ne pas être disponibles, des moyens chimiques pour détruire le GAG couche tel que le nitrate d'argent ou de poly-L-lysine peut également être utilisé ^{de 15 à 24.} Les tumeurs sont établies de manière efficace par une brève exposition de la vessie à un faible volume de nitrate d'argent (10.5 pl, 0,15 à 1,0 M, ~ 10 sec) ou plus en contact avec la poly-L-lysine (100 ul de 0,1 mg / ml pendant 20 min) (Tableau 1). Ici, nous décrivons une méthode qui utilise la trypsine afin de faciliter l'implantation de cellules MB49.

Dans une tentative pour améliorer les approches thérapeutiques pour le cancer de la vessie, la thérapie génique a attiré une attention considérable. D'un point de vue clinique, le cancer de la vessie est une cible idéale pour la thérapie génique grâce à l'accessibilité facile de l'organe et la capacité à fournir localement la charge utile. Les vecteurs viraux qui ont été explorées pour la thérapie génique du cancer de la vessie comprennent un virus de l'herpès simplex oncolytique ^{25, 26} retrovirus, le virus de la variole du canari ^27, le virus de la vaccine, AAV, et adenovirus ^28. Dans la seconde partie de notre protocole, nous décrivons un procédé pour la livraison virale qui est pratiquement identique à l'instillation de cellules tumorales. D'intérêt dans notre laboratoire est le développement de nouvelles approches en matière de délivrance de gènes, dont nous évaluons par bioluminescence en utilisant un vecteur adénovirus exprimant un transgène luciférase. Cependant, la méthodologie de cathétérisme de la vessie peut être utilisé pour la livraison de divers agents et a une large applicabilité donc.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinés et approuvés par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité à l'Université médicale de Caroline du Sud. Le protocole a été approuvé en vertu de l'USDA catégorie D pour la douleur. Une. Cellule Implantation Deux jours avant d'effectuer la procédure, la plaque 1 x 10 6 cellules MB49 en flacons T-25. Utilisation du DMEM élevé en glucose supplémenté avec …

Representative Results

Hématurie est observée dans presque toutes les souris dans les 8 jours après l'implantation de 200.000 MB49 cellules. Comme le montre la figure 1, le poids de la vessie a plus que doublé, passant de 34,7 ± 3,3 mg (gamme 31-37 mg, n = 4) non tumorales chez des souris porteuses de 87,5 ± 19,2 mg (gamme de 77 à 120 mg, n = 10) chez des souris ont été implantés avec des cellules MB49. En termes de délivrance de gènes, nous avons constaté que l'imagerie souris 24 heures après l'inst…

Discussion

La principale méthode décrite dans ce protocole est cathétérisme de vessies de souris, qui a de larges applications pour instillation de cellules ou un agent destiné à la distribution locale de l'épithélium de la vessie. Le protocole spécifique décrite ci-dessus a été optimisé pour les études à court terme (~ 10 jours). Implanter le nombre exact de cellules est critique, car un certain nombre de cellules plus élevée entraîne une croissance plus rapide de la tumeur et, éventuellement, la perte de l…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2