Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Summary

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Abstract

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital e novas abordagens terapêuticas que podem reduzir a recorrência ea progressão são necessários. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor e a resposta terapia. Por conseguinte, é muitas vezes desejável para crescer as células de tumor no órgão a partir do qual se originou. Este protocolo descreve um modelo ortotópico de cancro de bexiga, em que as células de carcinoma de bexiga de murino MB49 são instilada na bexiga através do cateterismo. Implantação de células de tumor bem sucedida, neste modelo requer a interrupção da camada de glicosaminoglicano de protecção, que pode ser realizada por meios físicos ou químicos. No nosso protocolo da bexiga é tratada com tripsina antes da instilação de células. Cateterização da bexiga podem também ser usados ​​para entregar agentes terapêuticos uma vez que os tumores estão estabelecidos. Este protocolo descreve o fornecimento de uma construção adenoviral que expressa um gene repórter da luciferase. Enquanto our protocolo foi otimizado para estudos de curto prazo e se concentra na entrega gene, a metodologia de rato cateterismo vesical tem amplas aplicações.

Introduction

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos e 15.000 mortes esperadas em 2012 ^1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida requerem acompanhamento, o que faz com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. Cancro da bexiga que invadiu a camada muscular podem metastizar para o fígado, o pulmão ou o osso através do sistema linfático. Terapia Multimodal de tumores avançados resultados em apenas 20-40% de sobrevida após 5 anos. Portanto, as estratégias de tratamento eficazes destinadas a reduzir a recorrência ea progressão do câncer superficial da bexiga, bem como melhorar os resultados terapêuticos em pacientes com doença avançada são urgentemente necessários.

Desenvolvimento de novas terapias requer modelos pré-clínicos para avaliar a eficácia após a avaliação inicial in vitro. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do câncer e capacidade de resposta, o que evidencia a necessidade de pré-clínicosal modelos em que os tumores surgem ou pode ser estabelecido no órgão de origem. Uma das abordagens é o desenvolvimento de modelos transgénicos em que os tumores surgem espontaneamente ou pode ser induzida de uma forma específica do órgão. Um excelente protocolo de um modelo de câncer de bexiga transgênico foi recentemente publicado ^2. A desvantagem de modelos transgénicos é que os tumores tendem a desenvolver-se lentamente e com menos uniformidade do que o desejado. Além disso, o custo de manutenção de uma colónia de reprodução tem de ser considerado. Uma alternativa aos modelos transgénicos é o implante ortotópico de células tumorais, o que tem a vantagem de prazos curtos para o estabelecimento do tumor em ratinhos disponíveis comercialmente. Enquanto algumas linhas celulares de cancro da bexiga humano pode ser cultivado ortotopicamente (temos utilizado com sucesso UM-UC-3), pode ser desejável estabelecer tumores em ratinhos imunocompetentes. Duas linhas celulares de cancro da bexiga murino, que crescem ortotopicamente são MBT-2 e MB49 ^3. Desde MBT-2 células estão contaminados com replicandotipo C retrovírus ^4, escolhemos MB49 células para os nossos estudos. É importante notar que a MB49 células foram isoladas a partir de um rato macho e implantes ortotópicos são por razões anatómicas realizados em ratos fêmeas. Este tem a vantagem de facilitar a identificação das células implantadas por meio de marcadores do cromossomo Y, mas a incompatibilidade de gênero pode ser um inconveniente para os estudos imunológicos.

O epitélio da bexiga é revestida por um (GAG) da camada de glicosaminoglicano, o qual funciona como uma barreira para a infecção por micro-organismos. Esta barreira também pode interferir com a implantação de células tumorais e de vários métodos têm sido desenvolvidos para superar esta dificuldade (Tabela 1). Eletrocautério tem sido amplamente utilizado como um meio físico para romper a camada de GAG ^5-13 e um eletrocautério demonstrando protocolo foi recentemente publicado na Jove ^14. No entanto, se uma unidade de electrocautério não estar disponível, meios químicos para destruir o GAG camada tais como nitrato de prata, ou poli-L-lisina também pode ser utilizada ^15-24. Os tumores são estabelecidos de forma eficaz através de uma breve exposição da bexiga a um pequeno volume de nitrato de prata (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 seg) ou mais, o contacto com poli-L-lisina (100 ul de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabela 1). Aqui, descrevemos um método que utiliza a tripsina para facilitar a implantação de células MB49.

Em uma tentativa de melhorar as abordagens terapêuticas para o câncer de bexiga, a terapia gênica tem atraído atenção significativa. De um ponto de vista clínico, o cancro da bexiga é um alvo ideal para terapia génica devido ao fácil acesso do órgão e a capacidade para distribuir localmente a carga útil. Os vetores virais que foram exploradas para a terapia genética câncer de bexiga incluem um vírus herpes simplex oncolítico ^{25, 26} retrovírus, vírus de canários ^27, o vírus vaccinia, AAV, e adenovirus ^28. Na segunda parte do nosso protocolo, que descrevem um método para a entrega viral que é virtualmente idêntico ao da instilação das células tumorais. De interesse no nosso laboratório é o desenvolvimento de novas abordagens para a entrega do gene, que avaliam através bioluminescência, utilizando um vector adenoviral que expressa um transgene da luciferase. No entanto, a metodologia de cateterização da bexiga pode ser utilizada para a entrega dos vários agentes e, portanto, tem ampla aplicabilidade.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisadas e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Medical University of South Carolina. O protocolo foi aprovado sob USDA categoria D para a dor. 1. Implantação celular Dois dias antes de realizar o procedimento, placa 1 x 10 6 MB49 células em frascos T-25. Use alta DMEM glucose suplementado com 10% FBS (e antibióticos, se desejar). Um frasco é suficiente para cada grupo de até cinco ratinho…

Representative Results

Hematúria é observado em quase todos os ratos num período de 8 dias após a implantação de 200.000 células MB49. Como mostrado na Figura 1, o peso da bexiga mais do que duplica de 34,7 ± 3,3 mg (gama 31-37 mg, n = 4) não tumorais em ratinhos portadores de 87,5 ± 19,2 mg (gama de 77-120 mg, n = 10) em ratinhos que foram implantados com células MB49. Em termos de entrega de genes, descobrimos que imagiologia ratinhos 24 horas após a instilação viral produz um sinal mais forte do que depois de…

Discussion

A metodologia principal descrito neste protocolo é o cateterismo de bexigas de rato, que tem amplas aplicações para a instilação de células ou qualquer agente destinado para entrega local para o epitélio da bexiga. O protocolo específico descrito acima foi otimizado para estudos de curto prazo (~ 10 dias). Implantar o número exato de células é fundamental, uma vez que um número de células maior resultará em crescimento do tumor e, possivelmente, mais rápida perda de animais devido a grande carga tumoral. …

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2