Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup> +</supMelanom dan> sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri
Summary
Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133<sup> +</sup> Farzedilen melanom kök hücreler CD133 doğru sıralanır<sup> -</sup> Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MACS) kullanarak toplu.
Abstract
Mevcut melanom bugün için daha iyi tedaviler seçenekleri rağmen, ileri malign melanom hastalarında hala progresyonsuz ve genel sağkalım için kötü bir prognoza sahiptir. Bu nedenle, translasyonel araştırma malign melanom için hedefli tedaviler geliştirmek için ileri moleküler kanıtlar sağlaması gerekir. Melanom ile ilgili geçmişte, onkojenik mekanizmalar yoğun yerleşik hücre hatları çalışıldı. Bireysel genetik profillerine dayalı daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimleri için yolda, biz hasta türevi hücre hatları yerine jenerik hücre hatları kullanmayı öneriyoruz. Birlikte özellikle hasta takibi üzerine yüksek kalitede klinik verilerle birlikte, bu hücreler daha melanoma ilerleme arkasında moleküler mekanizmaları anlamak için vesile olacaktır.
Burada disseke taze tümör dokusu primer melanom kültürlere kurulması rapor. Bu işlem, tek bir hücre içine kıyma ve doku ayrışma, yeniden içerireritrositler ve fibroblastlar gibi primer kültür ve hücrelerin melanom kökenli güvenilir doğrulama ile kontaminasyonların moval.
Son raporlar ortaya koydu melanomlar, tümörlerin çoğunluğu gibi, limana sadece metastatik devlete karşı tümör gelişimini ve ilerlemesini yakıt gibi kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu. Melanom CSC kimlik ve izolasyon için önemli belirteçler biri CD133 olduğunu. Primer melanom kültürlere ait CD133 + rulmanları yalıtmak için, değiştirilmiş ve Manyetik-Aktif Hücre yüksek sıralama saflıkta sonuçlanan Miltenyi gelen Sıralama (MACS) prosedürü ve CD133 + rulmanları ve CD133 canlılığı optimize – dökme, ekili ve fonksiyonel analiz edilebilir bundan sonra.
Introduction
Kutanöz malign melanom cilt kanseri en sık görülen, ama en ölümcül türüdür. Artan bir insidans, ölümleri 1,2 ilişkili malign deri tümörlerinin% 75 malignite ve hızlı yayılması bir yüksek dereceli, şimdi melanomlar hesabı nedeniyle. Primer tümör, kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve metastas melanom kombine kemoterapi ve immünoterapi cerrahi eksizyon yanında melanom tedavisinde 3,4 için state-of-the-art stratejilerdir. Ancak, malign melanom kemoterapötiklerin zayıf yanıt (% 5-12) 5,6 ve Hazır vemurafenib 7 ile tedavi gibi yeni hedefli tedaviler vadeden BRAF V600E gen mutasyonunun yararı taşıyan melanom hastalarının yalnızca% 50-70 ile karakterizedir sağkalımı, melanom Tümörgenez mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir.
Geçmişte, köklü ticari bu mekanizmaların incelenmesilikle mevcut hücre çizgileri kullanıldı. Kanser başlangıcı ve ilerlemesindeki moleküler olayları incelemek için daha yeni yaklaşımlar tümör dokusunun doğrudan elde primer kültürlerinde kullanmak – bir strateji rulman manifoldu faydaları: araştırmacı hasta ve doku seçimi üzerinde tam denetime sahiptir. Örneklenen hücreler ustaca seçilen tümör dokusu elde, tüm heterojenite ile tümörü andıran ve takip hastanın verileri ve ayrıntılı patoloji kültürünün özelliklerini orijinal tümör 8 ile karşılaştırıldı izin vermek için kullanılabilir.
Buna karşılık, kanser araştırma ilgili model sistem olarak oluşturulmuş hücre hattını kullanmak tartışılmaktadır. Zaten 1987 yılında Osborne ve arkadaşları farklı laboratuvarlarda 9 MCF-7 insan meme kanseri hücre hatları arasında önemli biyolojik farklılıklar açıklanmıştır. Altkültür sırasında RNA ekspresyonunda Bu geniş genomik kararsızlık ve değişkenlik işbirliği olduHiorns ark nfirmed. ve hücre hatları böylece insan kanser 10 modelleri gibi kurulan kültürlerin doğrudan alaka zayıflaması, kültür gelişmeye emin delil destekleyici veriler sağladı.
Büyük ölçüde yıllar boyunca ihmal edilen bir diğer önemli göz, hücre hatları çok sayıda HeLa ile kirlenmiş olduğunu ilk göstererek yirmi yıl önce çizildi ilgisiz 'false' hücreleri ile kültürlerin kontaminasyon veya büyümesi riski olduğunu hücreleri 8,11. 'Yanlış' hücre hatları verilerin yanlış yorumlanmasına son zamanlarda tekrar literatürde açık olarak ortaya çıkmıştır. DNA profili ve moleküler sitogenetik bir arada kullanarak, McLeod ve ark. 252 yeni tümör türevli insan hücre hatları, Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri (DSMZ), Alman Collection tevdi yaklaşık% 18 oranında intraspecies olduğu bulunmuştur ya da çapraz türler arası olduğunu göstermiştir -kirletici 12,13.
Bu sorunları önlemek için ve yukarıda belirtilen avantajlardan yararlanmak için, biz yeni eksize metastaz düşük-geçiş melanom hücre hatları kurmaya karar verdi.
Sağlam hücre ayırma ve analiz teknolojileri eşzamanlı karakteristik yüzey proteinleri hücre ölüm ve yıkım sınırlayan ise tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tek hücre süspansiyonları içine dokuların otomatik ayrışma için benchtop enstrüman Miltenyi tarafından imal GentleMACS Dissociator olduğunu. Antijen epitoplarının korunması ve hücre kaybını azaltma süre GentleMACS C tüp ve optimize edilmiş ayrışma çözeltiler, kapalı bir sistem içerisinde tümör dokusunda etkili ve yumuşak bir ayrılma ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman elde edilir. Enstrüman özel uygulamalar ve teminatlar melanom dokusunun 14 tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık çeşitli için optimize edilmiş, önceden ayarlanmış programları sunmaktadır.
<p class = "jove_content"> tümörlerin çoğunluğu sadece tümör başlatılması ve kapasite kendini yenileyen sergilerler denilen kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu liman ortaya çıkanlar raporlar. Derinin dermis melanosit üreten kök hücrelerinin tanımlanması UVA ışınlarına maruz malign transformasyon 15 için bu hücreleri hazırlamak çünkü bu hücrelerin melanom kanser kök hücreleri (rulmanları) kökeni olabileceği hipotezini doğurmuştur. Bu tür bir genetik lezyon sonucu, tümör ve kök hücre özelliklerinin bir kombinasyonu liman hücreler olacaktır.Melanom rulmanları ve alt sınıfı için önerilen anahtar belirteçlerin biri CD133 16-20 olduğunu. CD133 (ayrıca Prominin 1 olarak da bilinir), pentaspan transmembran glikoproteinler üyesi, hematopoetik kök hücreler, endotelyal progenitör hücreleri, nöronal ve glial kök hücreleri 21-23 olarak ifade edilir. CD133 ekspresyonu ile korelasyonasimetrik hücre bölünmesi 24, ve CD133 ve glikosilatlı epitop 25 hücre farklılaşması üzerine aşağı regüle olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, CD133 + melanom hücrelerinin kendini yenileme ve tümör-inisiyasyon kapasitesi 19,20 olduğu gösterilmiştir.
CD133 + olası melanom rulmanları fonksiyonunu incelemek için, değiştirilmiş ve CD133 yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonları + ve CD133 elde Miltenyi Biotech gelen Manyetik-Aktif Hücre Ayırma (MACS) sistemi optimize – hücreleri.
Matheu ark gösterildiği gibi Manyetik boncuk tabanlı hücre ayırma ya negatif seçim için izin verir. 26 veya pozitif seleksiyon Burada göstereceğimiz gibi. Pozitif seçimi sırasında özellikle hedef hücre tipi, örneğin CD133 eksprese eden hücrelerin, manyetik bir karşı yüksek düzeyde özgül antikorlarla konjuge olan microbeads, 50-nm Süperparamanyetik parçacıkları ile etiketlenmiştirözel hücre yüzeyi antijenine. Etiketsiz hücreleri akmasına ise ayrılık sırasında, manyetik etiketli hücreleri, ayırıcı manyetik alanında sütun içinde korunur. Yıkama adımları takiben, sütun ayırıcı manyetik alan kaldırılır ve hedef hücrelerin sütundan elüt edilmiştir. LS veya MS sütunları yüksek saflıkta etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonları pozitif seleksiyon sonucu sırasında kullanılır. Diğer taraftan, negatif seleksiyon için kullanılan LD kolonlar, etiketli fraksiyonunun biraz daha düşük bir saflık ile sonuçlanır. Bunların matris ambalaj yoğun olması nedeniyle bu sütunlarda debi sütununda tuzağa, etiketsiz hücrelerin daha yüksek bir risk düşük sonuç olduğunu. LD sütunları nedenle istenmeyen bir hücrenin alt populasyonun sıkı tükenmesi için kullanılmalıdır. Pozitif seçim incubatio aşağıdaki mikro-küreler ile doğrudan (mikro-küreler bağlanmış antikor) veya dolaylı manyetik etiketleme (kuluçka ile gerçekleştirilebilirN birincil antikor ile birlikte). Spesifik MACS mikro-küreler ya da prostat melanom 27 gibi primer tümör hücrelerinin çok sayıda hücre tiplerinin pozitif seçim için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör hücre pelet eritrosit kontaminasyonu kaldırmak için biz son derece Miltenyi gelen kırmızı kan hücre lizis çözüm kullanmanızı öneririz. Geleneksel Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj üzerine eritrositlerin parçalayıcı avantajları, daha hızlı ve daha basit olmasıdır. Ayrıca, Ficoll ve kırmızı kan hücreleri ve tümör hücreleri kaybı ile kirlilikler önlenir. Çok uzun beklerken normalde tümör hücrelerinin Overgrow beri primer hücre kültürü fibroblastların büyümesini gözlemle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu işi desteklemek ve eleştirel bir yazının okunması için M. Dietel ve Dirk Schumacher ederim.
Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt ° 115234, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA şirketlerin 'in mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklardan destek aldı Ayni katkı. Bu çalışma aynı zamanda Berliner Krebsgesellschaft (BKG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
References
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
- Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
- Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. . Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).
- Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
- Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
- Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
- Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
- Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
- Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
- Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
- Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
- Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
- Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
- Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
- Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
- Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
