Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen
Summary
De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en antigenen behouden in het CZS te bestuderen en synaptische eiwitten karakteriseren rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen.
Abstract
Immuno microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen te bestuderen op het subcellulaire niveau. Antilichamen gekoppeld aan elektron-dichte markers zoals colloïdaal goud kan onthullen de lokalisatie en distributie van specifieke antigenen in verschillende weefsels 1. De twee meest gebruikte technieken zijn pre-embedding en na inbedding technieken. In pre-embedding immunogoud-elektronenmicroscopie (EM) techniek, moet het weefsel worden gepermeabiliseerd om antilichaam kan binnendringen voordat het wordt ingebed. Deze technieken zijn ideaal voor het bewaren van organen, maar slechte penetratie van het antilichaam (vaak alleen de eerste paar micrometer) een aanzienlijk nadeel 2. De post-embedding labeling methoden kunnen voorkomen dat dit probleem, omdat de etikettering vindt plaats op delen van vaste weefsels waar antigenen zijn gemakkelijker toegankelijk. Over de jaren zijn een aantal wijzigingen verbeterde de post-embedding methoden immunoreactiviteit verbeteren en ultrastructuur behouden <sup> 3-5.
Tissue fixatie is een cruciaal onderdeel van EM studies. Fixatieven chemisch verknopen de macromoleculen om het weefsel structuren te vergrendelen. De keuze van fixatief beïnvloedt niet alleen structurele conservering maar ook antigeniciteit en contrast. Osmiumtetroxide (OSO 4), formaldehyde en glutaaraldehyde zijn de standaard fixatieven decennia, met inbegrip van het centrale zenuwstelsel (CNS) weefsels die vooral gevoelig voor structurele schade tijdens chemische of fysische bewerkingen. Helaas OSO 4 is zeer reactief en is aangetoond dat maskeren antigenen 6, resulterend in slechte en onvoldoende labeling. Alternatieve benaderingen van chemische fixatie te vermijden onder meer het bevriezen van de weefsels. Maar deze technieken zijn moeilijk en vereisen dure apparatuur. Om sommige van deze problemen aan te pakken en CZS etikettering Phend et al. verbeteren. vervangen OSO 4 met uranylacetaat (UA) en tannine acid (TA), en met succes bijkomende wijzigingen van de gevoeligheid van antigeen en structurele conservering hersenen en ruggenmerg weefsels 7 verbeteren. We hebben deze osmium-vrij na inbedding methode om ratten hersenweefsel en geoptimaliseerd de immunogoud etikettering techniek voor het opsporen en bestuderen synaptische eiwitten.
We presenteren hier een methode om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen te bepalen. We maken gebruik van organotypische hippocampus gekweekte plakjes. Deze schijfjes handhaven van de trisynaptic circuit van de hippocampus, en zijn dus vooral handig voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, een mechanisme in brede kring te leren en geheugen ten grondslag liggen. Organotypische hippocampale plakken van postnatale dag 5 en 6 muizen / ratten worden bereid zoals eerder beschreven 8 en zijn bijzonder nuttig om acute knockdown of overexpressie exogene eiwitten. We hebben eerder gebruikt dit protocol om characterize neurogranin (Ng), een neuron-specifiek eiwit een kritische rol in het reguleren synaptische functie 8,9. We hebben ook gebruikt om de lokalisatie van ultrastructurele calmoduline (CaM) en Ca 2 + / CaM-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKII) 10 karakteriseren. Zoals weergegeven in de resultaten, dit protocol zorgt voor een goede ultrastructurele behoud van dendritische spines en efficiëntie-etikettering van Ng te helpen karakteriseren te verspreiden over de rug 8. Bovendien is de hier beschreven procedure kan brede toepasbaarheid hebben bij het bestuderen van vele andere eiwitten betrokken bij neuronale functies.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we aangenomen Phend en Weinberg methode voor de hersenen en het ruggenmerg weefsels om dendritische spines in rat hippocampale slice culturen te bestuderen. Dendritische spines in de hippocampus CA3-CA1 gebied zijn delicate structuren met een grote verscheidenheid aan eiwitten die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van neuronale functies. De onderhavige methode biedt een evenwicht te bereiken verbeterde antigeniciteit met behoud van goede conservering ultrastructurele (Figuur 2A)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Matthew Florence bedanken voor de voorbereiding van de hippocampus slice culturen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van US National Institute on Aging en Alzheimer's Association te NZG.
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5′-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).
