Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto
Summary
La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.
Abstract
La insuficiencia cardíaca avanzada representa un importante desafío clínico insatisfecha, derivada de la pérdida de células musculares viables y / o funcional totalmente cardíacas. A pesar de la terapia óptima del fármaco, la insuficiencia cardiaca es una causa principal de mortalidad y morbilidad en el mundo desarrollado. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que recapitulan precisión normal y enfermo fisiología humana miocardio in vitro. Del mismo modo, los principales retos de la biología regenerativa cardíaca giran en torno a la identificación y el aislamiento de pacientes específicos de células progenitoras cardiacas en cantidades clínicamente relevantes. Estas células tienen que luego se ensamblan en tejido funcional que se asemeja a la arquitectura del tejido del corazón nativo. Impresión por microcontacto permite la creación de formas precisas que se asemejan a proteínas micropatterned organización estructural del corazón, proporcionando así señales geométricas para controlar la adhesión celular espacialmente. En estadescribimos nuestro enfoque para el aislamiento de las células del miocardio altamente purificada a partir de células madre pluripotentes de diferenciación in vitro, la generación de superficies de crecimiento de células micropatterned con proteínas de matriz extracelular, y el conjunto de las células madre derivadas de células del músculo cardiaco en el tejido de miocardio anisotrópico.
Introduction
A pesar de los recientes avances en el tratamiento médico, la insuficiencia cardíaca avanzada sigue siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en los países desarrollados. El síndrome clínico surge de una pérdida de tejido funcional del miocardio y, posteriormente, la incapacidad del corazón insuficiente para satisfacer las demandas metabólicas de los individuos afectados. Puesto que el corazón tiene una capacidad regenerativa limitada, el trasplante autólogo de corazón es el único tratamiento actual clínicamente aceptado directamente dirigidas a la reposición de tejido perdido corazón funcional. Inconvenientes significativos de trasplante de corazón, incluyendo un número limitado de corazones de donantes y la necesidad de que a largo plazo la terapia inmunosupresora, impide el uso generalizado de esta terapia. Como resultado, la terapia médica ha sido el pilar del tratamiento para los pacientes con enfermedades del corazón. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que precisa recapitular fisiología del miocardio normal y enfermo in vitro.
La convergencia reciente de la biología de células madre y la tecnología de la ingeniería de tejidos plantea nuevas vías prometedoras para la regeneración cardiaca. Generación de tejido miocárdico funcional de un renovable específica del paciente fuente, sería un avance importante en el campo. Esto permitiría el desarrollo de enfermedades específicas ensayos celulares para el desarrollo y descubrimiento de fármacos y podría establecer las bases para la medicina regenerativa cardíaca. Humanos madre embrionarias (ES) de células y, significativamente más, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) representan una potencialmente renovable específica del paciente fuente de células progenitoras y los miocitos ventriculares maduros ventriculares. La combinación de la biología de células madre y la ingeniería de tejidos aborda este problema mediante la generación de tejido cardiaco funcional in vitro que se pueden utilizar en el desarrollo de ensayos celulares para el descubrimiento de medicamentos o en cardíacos enfoques regenerativos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca avanzada.
_content "> Un reto fundamental en la regeneración cardiaca ha sido la identificación de un tipo celular óptimo. Una amplia variedad de células han sido estudiados 1, sin embargo hasta la fecha, a pesar de diferentes precursores multipotenciales cardiogénicas de diversas fuentes han sido descubiertos, la identificación de una célula fuente que cumpla con los requisitos críticos tales como el compromiso con el destino de la célula miogénica, el mantenimiento de la capacidad de expandir in vivo o in vitro y la composición a un tejido miocárdico funcional ha demostrado ser un problema central 2. Hemos descrito previamente un doble sistema murino transgénico que permite el aislamiento de poblaciones altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventriculares (CVP) de la diferenciación de células ES in vitro. Hemos generado un nuevo ratón doble transgénico que expresa la proteína fluorescente roja DsRed bajo el control de un potenciador dependiente de ISL1 del gen y MEF2C el aumento de proteína verde fluorescente bajo el control deel específico del corazón Nkx2.5 potenciador. Sobre la base de este sistema reportero fluorescente de dos colores, progenitores corazón primero y segundo de campo de las células ES en desarrollo pueden ser aislados por medio de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con su expresión de genes y MEF2C Nkx2.5. CVP se asemejan a los miocitos cardíacos basados en los patrones de expresión de marcadores miocárdicos y cualidades estructurales y funcionales de 3, lo que ofrece una gran promesa para los propósitos de tejidos cardíacos regenerativas.Aunque ha habido muchos avances en el campo de la ingeniería de tejidos, imitando la arquitectura celular natal sigue siendo un desafío clave. Los métodos convencionales para hacer frente a este reto incluyen la siembra andamios biológicos o sintéticos con células in vitro. Debido a un número de desventajas de los andamios, incluyendo una rápida degradación, la estabilidad física y mecánica limitada y baja densidad celular 1,4,5, hemos intentado diseñar andamios menos tejido. AltHough células cardiacas pueden modificar su microentorno local por la secreción de proteínas de matriz extracelular, que tienen una capacidad más limitada para organizarse a la varilla miocitos cardiacos con forma en la ausencia de señales extracelulares. Por lo tanto, una plantilla que proporciona células apropiadas señales espaciales y biológicos para componer el tejido miocárdico funcional se requiere. La impresión por microcontacto aborda este reto proporcionando una técnica sencilla y barata para controlar con precisión la forma celular, la organización y función 6-8, todos los cuales son cruciales para la generación de alineado tejido miocárdico funcional. Comprende el uso de Microtexturados polidimetilsiloxano (PDMS) sellos con tamaños de las características que van a 2 micras 9 que permiten la deposición de proteínas de matriz extracelular sobre sustratos de PDMS en patrones precisos y por lo tanto afectar a la adhesión celular espacialmente.
En este documento, se propone combinar la tecnología de bioingeniería de tejidos con tallo cell biología para generar anisotrópico tejido miocárdico funcional. En consecuencia, aquí demuestran nuestro enfoque publicado recientemente por el siguiente: (1) la generación de superficies de las proteínas microestructurada en PDMS sustratos por impresión por microcontacto para la generación de un modelo de tejido de miocardio alineados, (2) el aislamiento de alta pureza a partir de progenitores cardíacos diferenciación de células ES in vitro, y (3) la combinación de ambas técnicas para generar alineado tejido miocárdico funcional.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, hemos presentado un método para aislar poblaciones purificadas de células progenitoras cardiogénico y sembrar en ellos micropatterned sustratos fibronectina lo que les permite alinear y dar un miocito cardíaco-como forma de bastón. Organización celular normal es crítica para la función del tejido normal de 8,10, en particular para el tejido miocárdico. Los miocitos cardíacos se ha demostrado que desarrollar mecánica mejorada y propiedades electrofisiológicas 11,12 11,13</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo se llevó a cabo, en parte, en el Centro de Sistemas de nanoescala (SNC), miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura (NNIN), que es apoyada por la National Science Foundation NSF con la beca no. ECS-0.335.765. CNS es parte de la Universidad de Harvard.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
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