توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact
Summary
توليد الأنسجة عضلة القلب الانحياز هو مطلب رئيسي لتكييف التطورات الحديثة في بيولوجيا الخلايا الجذعية لأغراض مفيدة سريريا. هنا نحن تصف نهج الطباعة microcontact لمراقبة دقيقة من شكل الخلية ووظيفتها. استخدام عالي النقاء السكان من الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الأسلاف القلب، ونحن توليد الأنسجة عضلة القلب ثم متباين الخواص الوظيفية.
Abstract
قصور القلب المتقدمة يمثل أحد أكبر التحديات التي لم تلب السريرية، والتي تنشأ من فقدان قابلة للحياة و / أو وظيفية بالكامل خلايا عضلة القلب. على الرغم من العلاج الدوائي الأمثل، وفشل القلب تمثل السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة الطبيعي وعلم وظائف الأعضاء المريضة عضلة القلب الإنسان في المختبر. وبالمثل، فإن التحديات الرئيسية في مجال البيولوجيا القلب التجدد تدور حول تحديد وعزل المريض محددة الأسلاف القلب بكميات ذات الصلة سريريا. هذه الخلايا ثم يجب أن يتم تجميعها في الأنسجة الوظيفية التي تمثل العمارة المحلية أنسجة القلب. الطباعة Microcontact يسمح لإنشاء الأشكال الدقيقة البروتين micropatterned التي تشبه التنظيم الهيكلي للقلب، وبالتالي توفير العظة الهندسية للسيطرة على التصاق الخلايا مكانيا. هناوصفنا نهجنا لعزل خلايا عضلة القلب عالي النقاء من الخلايا الجذعية المحفزة التفريق في المختبر، وتوليد السطوح نمو الخلايا micropatterned مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والجمعية من الخلايا الجذعية المستمدة من خلايا عضلة القلب إلى نسيج عضلة القلب متباين الخواص.
Introduction
على الرغم من التطورات الحديثة في العلاج الطبي، قصور القلب المتقدمة لا يزال السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. متلازمة سريرية تنشأ من فقدان أنسجة عضلة القلب الوظيفية وبعد ذلك عدم قدرة القلب فشلها في تلبية مطالب الأيضية للأفراد المتضررين. منذ القلب لديه قدرة محدودة التجدد، ذاتي زرع القلب هو العلاج الوحيد الحالي قبلت سريريا تهدف بصورة مباشرة إلى تجديد أنسجة القلب فقدت وظيفية. عيوب كبيرة زرع القلب، بما في ذلك عدد محدود من قلوب المانحة والحاجة إلى المعالجة طويلة المدى مناعة يحول دون انتشار واسع لاستخدام هذا العلاج. ونتيجة لذلك، كان العلاج الطبي الدعامة الأساسية لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة عضلة القلب الفيزيولوجيا العادية والمريضة في المختبر.
التقارب الأخير لبيولوجيا الخلية الجذعية والأنسجة تكنولوجيا الهندسة يثير سبل جديدة واعدة لتجديد القلب. وتوليد الأنسجة القلبية وظيفية من مصدر المريض محددة قابلة للتجديد تكون تقدما كبيرا في هذا المجال. هذا من شأنه أن يسمح لتطوير فحوصات الأمراض الخلوية محددة لتطوير العقاقير واكتشاف وسوف يضع الأساس للطب التجديدي القلب. الإنسان الجذعية الجنينية (ES) والخلايا، بشكل ملحوظ أكثر من ذلك، الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها الخلايا (آي بي إس) تمثل المتجددة يحتمل المريض محددة مصدر الخلايا الاصلية البطين والبطين myocytes ناضجة. الجمع بين علم الأحياء الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة استراتيجيات تعالج هذه المشكلة عن طريق توليد أنسجة القلب وظيفية في المختبر والتي يمكن استخدامها في تطوير المقايسات الخلوية لاكتشاف المخدرات أو في النهج التجديدي القلب لعلاج قصور القلب المتقدمة.
_content "> قد يشكل تحديا رئيسيا في تجديد القلب تحديد نوع الخلية المثلى. وقد تم دراسة مجموعة واسعة من A الخلايا 1، لكن حتى الآن، على الرغم من أن تم اكتشاف مختلف السلائف قلبية متعددة القدرات من مصادر مختلفة، وتحديد خلية المصدر الذي يلبي متطلبات الأساسية مثل الالتزام مصير الخلية عضلي، وقد ثبت صيانة القدرة على التوسع في الجسم الحي أو في المختبر، وتكوين الأنسجة وإلى عضلة القلب وظيفية مشكلة المركزية 2. لقد سبق وصفها نظام مزدوج الفئران المعدلة وراثيا تمكن من عزل عالي النقاء من السكان الأسلاف البطين الملتزمين (CVP) من خلايا ES التفريق في المختبر، ونحن ولدت رواية الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن ضعف البروتين الحمراء الفلورسنت dsRed تحت سيطرة محسن Isl1 التي تعتمد على الجينات وMEF2c وتعزيز بروتين الفلورية الخضراء الخاضعة لسيطرةوالقلب محددة Nkx2.5 محسن. بناء على هذا النظام لمدة الملونة مراسل الفلورسنت، والأولى والثانية من القلب الأسلاف مجال الخلايا الجذعية الجنينية النامية يمكن أن تكون معزولة عن طريق الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) وفقا لتعبيره من MEF2c والجينات Nkx2.5. CVP تشبه myocytes القلب استنادا إلى أنماط التعبير عن علامات عضلة القلب والصفات الهيكلية والوظيفية 3، ما يقدم وعدا كبيرا لأغراض التجدد القلب الأنسجة.وإن كانت هناك العديد من التطورات في مجال هندسة الأنسجة، ومحاكاة العمارة الخلوية المحلية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا. الأساليب التقليدية لمواجهة هذا التحدي وتشمل البذر السقالات البيولوجية أو الاصطناعية مع خلايا في المختبر. بسبب وجود عدد من العيوب من السقالات، بما في ذلك تدهور السريع، ومحدودية الاستقرار الفيزيائية والميكانيكية وانخفاض كثافة الخلايا 1،4،5، حاولنا لهندسة الأنسجة سقالة أقل. ALTهوغ خلايا القلب يمكن تعديل المكروية المحلية من إفراز البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لديهم قدرة محدودة أكثر على تنظيم أنفسهم لmyocytes قضيب على شكل القلب في حالة عدم وجود إشارات خارج الخلية. وبالتالي، لا بد من القالب الذي يقدم العظة المكانية المناسبة الخلايا والبيولوجية لتكوين الأنسجة عضلة القلب وظيفية. الطباعة Microcontact يتناول هذا التحدي من خلال توفير تقنية بسيطة وغير مكلفة للسيطرة على وجه التحديد شكل الخلية، والتنظيم، وظيفة 6-8، وكلها حاسمة بالنسبة لجيل من الأنسجة الانحياز عضلة القلب وظيفية. ويضم استخدام الطوابع microtextured (PDMS) Polydimethylsiloxane مع أحجام تتراوح ميزة أسفل إلى 2 ميكرون 9 أن تمكين ترسب البروتينات المصفوفة خارج الخلية على ركائز PDMS في أنماط دقيقة وبالتالي تؤثر على التصاق الخلايا مكانيا.
هنا، نقترح الجمع بين الأنسجة تكنولوجيا الهندسة الحيوية مع سل الجذعيةL البيولوجيا لتوليد أنسجة عضلة القلب متباين الخواص الوظيفية. وفقا لذلك، علينا أن نبرهن هنا نهجنا نشرت مؤخرا ما يلي: (1) توليد الأسطح البروتين micropatterned على ركائز PDMS من الطباعة microcontact لتوليد نموذج للالأنسجة الانحياز عضلة القلب، (2) عزل عالي النقاء الأسلاف من القلب خلايا ES التفريق في المختبر، و (3) الجمع بين كل من التقنيات لتوليد الانحياز الأنسجة عضلة القلب وظيفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، قدمنا طريقة لعزل السكان تنقيته من الأسلاف قلبية والبذور منها على ركائز [فيبرونكتين] micropatterned ما يسمح لهم التوفيق واتخاذ شكل قضيب خلية عضلية قلبية مثل. منظمة الخلوية العادية أمر بالغ الأهمية من أجل وظيفة الأنسجة الطبيعية 8،10، ولا سيما بالنس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تنفيذ هذا العمل في جزء في مركز نظم النانومترية الحجم (CNS)، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية (NNIN)، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية NSF تحت أي جائزة. ECS-0335765. CNS هو جزء من جامعة هارفارد.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
