Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto
Summary
La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.
Abstract
Insufficienza cardiaca avanzata rappresenta un'importante sfida clinica insoddisfatta, derivanti dalla perdita di vitali e / o completamente funzionale cellule muscolari cardiache. Nonostante la terapia farmacologica ottimale, scompenso cardiaco rappresenta una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l'identificazione di saggi cellulari che ricapitolano precisione normale e patologica del miocardio fisiologia umana in vitro. Allo stesso modo, le principali sfide in biologia rigenerativa cardiaca ruotano intorno alla identificazione e l'isolamento di progenitori cardiaci paziente-specifici in quantità clinicamente rilevanti. Queste cellule devono poi essere assemblati in tessuto funzionale analogo al nativo architettura del tessuto cardiaco. Stampa microcontact consente la creazione di precise forme proteiche micropatterned che assomigliano organizzazione strutturale del cuore, fornendo così spunti geometriche per controllare l'adesione cellulare spazialmente. Quidescriviamo il nostro approccio per l'isolamento di cellule miocardiche altamente purificato da cellule staminali pluripotenti differenziazione in vitro, la generazione di superfici di crescita cellulare micropatterned con proteine della matrice extracellulare, e l'assemblaggio delle cellule derivate da cellule staminali muscolari cardiache in anisotropo tessuto miocardico.
Introduction
Nonostante i recenti progressi nella terapia medica, scompenso cardiaco avanzato rimane una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. La sindrome clinica nasce da una perdita di tessuto miocardico funzionale e successivamente una incapacità del cuore scompensato per soddisfare le richieste metaboliche dei soggetti affetti. Dal momento che il cuore ha una capacità limitata di rigenerazione, il trapianto di cuore autologo è l'unica terapia in corso clinicamente accettati direttamente volto a rifornire perso tessuto funzionale del cuore. Svantaggi significativi del trapianto di cuore, tra cui un numero limitato di cuori donatori e alla necessità di una terapia a lungo termine immunosoppressiva, preclude l'uso molto diffuso di questa terapia. Come risultato, la terapia medica è stato il cardine del trattamento per pazienti con malattia cardiaca. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l'identificazione di saggi cellulari che ricapitolano accuratamente fisiologia normale e patologica del miocardio in vitro.
La convergenza recente di biologia delle cellule staminali e l'ingegneria dei tessuti tecnologia solleva nuove vie promettenti per la rigenerazione cardiaca. Generazione funzionale del tessuto miocardico da un rinnovabili paziente-specifica fonte sarebbe un importante passo avanti nel campo. Ciò consentirebbe lo sviluppo di malattie saggi specifici cellulari per lo sviluppo di farmaci e di scoperta e avrebbe posto le basi per la medicina rigenerativa cardiaca. Umane staminali embrionali (ES), le cellule e, soprattutto, umane staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule rappresentano un potenziale rinnovabile paziente-specifica fonte di cellule progenitrici ventricolari e dei miociti ventricolari maturi. La combinazione di biologia delle cellule staminali e strategie di ingegneria tessutale risolve questo problema generando tessuto cardiaco funzionale in vitro che possono essere utilizzati per lo sviluppo di saggi cellulari per la scoperta di farmaci o in cardiaci approcci rigenerativi per il trattamento di insufficienza cardiaca avanzata.
_content "> Una sfida centrale nella rigenerazione cardiaca è stata l'identificazione di un tipo cellulare ottimale. Una vasta gamma di cellule sono state studiate 1, tuttavia ad oggi, pur differenti precursori multipotenti cardiogeniche da fonti diverse sono stati scoperti, l'identificazione di una cellula fonte che soddisfa i requisiti critici come impegno per il destino cellulare miogenico, mantenimento della capacità di espandersi in vivo o in vitro e la composizione di un tessuto funzionale del miocardio ha dimostrato di essere un problema centrale 2. Abbiamo precedentemente descritto un doppio sistema transgenico murino che permette l'isolamento di popolazioni altamente purificate di progenitori ventricolari impegnati (CVP) da cellule ES differenziazione in vitro. Abbiamo generato un romanzo topo transgenico doppia che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed sotto il controllo di un Isl1-dipendente enhancer del gene MEF2C e rafforzata di proteina fluorescente verde sotto il controllo diil cardio-specifica Nkx2.5 enhancer. Sulla base di questa bicolore sistema reporter fluorescente, primo e secondo progenitori cardiaci campo da cellule ES di sviluppo possono essere isolati mediante fluorescenza activated cell sorting (FACS) secondo la loro espressione di MEF2C e Nkx2.5 geni. CVP assomigliano miociti cardiaci in base agli schemi di espressione dei marcatori del miocardio e le qualità strutturali e funzionali 3, quello che offre una grande promessa per scopi di rigenerazione dei tessuti cardiaci.Anche se ci sono stati molti progressi nel campo dell'ingegneria tissutale, imitando nativo architettura cellulare rimane una sfida fondamentale. I metodi convenzionali per affrontare questa sfida sono semina scaffold biologici o sintetici con cellule in vitro. Causa di una serie di svantaggi, tra scaffold rapida degradazione, limitata stabilità fisica e meccanica e bassa densità cellulare 1,4,5, abbiamo tentato di progettare scaffold-meno tessuto. AltHough cellule cardiache possono modificare il loro microambiente locale, attraverso la secrezione di proteine della matrice extracellulare, hanno una capacità più limitata ad organizzarsi per asta a forma di miociti cardiaci in assenza di segnali extracellulari. Così, un modello che fornisce indicazioni appropriate cellule spaziali e biologici a comporre funzionale tessuto miocardico è richiesto. Stampa microcontact risolve questo problema fornendo una tecnica semplice ed economico per controllare con precisione la forma delle cellule, organizzazione e funzione 6-8, tutti che sono cruciali per la generazione di allineato tessuto funzionale del miocardio. Esso comprende l'uso di microtextured polidimetilsilossano (PDMS) francobolli con dimensioni caratteristiche che variano fino a 2 micron 9 che permettono la deposizione di proteine della matrice extracellulare su substrati PDMS in schemi precisi e quindi di incidere adesione cellulare spazialmente.
Qui, ci si propone di combinare la tecnologia della bioingegneria dei tessuti con stelo cell biologia per generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio. Di conseguenza, abbiamo qui dimostrano nostro approccio recentemente pubblicato per i seguenti: (1) la generazione di superfici proteiche micropatterned il PDMS substrati da stampa microcontact per la generazione di un modello per il tessuto miocardico allineati, (2) l'isolamento di altamente purificata da progenitori cardiaci cellule ES differenziazione in vitro, e (3) la combinazione di entrambe le tecniche per generare allineato funzionale tessuto miocardico.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo presentato un metodo per isolare popolazioni purificate di cellule progenitrici cardiogeno e alle sementi li micropatterned substrati fibronectina ciò che permette loro di allineamento e di prendere un miociti cardiaci forma a bacchetta. Normale organizzazione cellulare è fondamentale per la funzione tessuto normale 8,10, in particolare per il tessuto miocardico. Miociti cardiaci hanno dimostrato di sviluppare meccaniche migliorate proprietà elettrofisiologiche 11,12</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato svolto in parte presso il Centro per i sistemi su nanoscala (CNS), un membro della rete nazionale per le infrastrutture Nanotechnology (NNIN), che è supportato dalla National Science Foundation NSF in premio n. ECS-0335765. CNS fa parte della Harvard University.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
