Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact
Summary
A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.
Abstract
Insuficiência cardíaca avançada representa um desafio unmet clínica principal, resultante da perda de viabilidade e / ou completamente funcional das células musculares cardíacas. Apesar da terapia de droga ideal, insuficiência cardíaca representa a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo desenvolvido. Um dos principais desafios no desenvolvimento de drogas é a identificação de ensaios celulares com precisão que recapitulam normal e doente fisiologia humana do miocárdio in vitro. Do mesmo modo, os principais desafios na biologia regenerativa cardíaca giram em torno da identificação e isolamento de células progenitoras específicas do paciente cardíaco em quantidades clinicamente relevantes. Estas células têm para, em seguida, ser montado em tecido funcional que se assemelha a arquitectura do tecido nativo coração. Impressão microcontact permite a criação de formas precisas de proteína que se assemelham a micropatterned organização estrutural do coração, assim fornecendo pistas geométricas para controlar a adesão celular espacialmente. Aquidescrevemos a nossa abordagem para o isolamento de células do miocárdio altamente purificada a partir de células estaminais pluripotentes de diferenciação in vitro, a produção de superfícies de células de crescimento micropatterned com proteínas da matriz extracelular, e a montagem das células-tronco derivadas de células do músculo cardíaco no tecido do miocárdio anisotrópica.
Introduction
Apesar dos recentes avanços na terapia médica, insuficiência cardíaca avançada é a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo desenvolvido. A síndrome clínica surge de uma perda de tecido funcional do miocárdio e, posteriormente, uma incapacidade do coração insuficiente para atender as demandas metabólicas de indivíduos afetados. Como o coração tem uma capacidade limitada de regeneração, o transplante autólogo de coração é a única terapia atual clinicamente aceito diretamente destinado a reabastecer o tecido do coração perdido funcional. Desvantagens significativas do transplante cardíaco, incluindo um número limitado de corações de dadores e a necessidade de uma terapia de longo prazo imunossupressora, impede a utilização ampla desta terapia. Como resultado, a terapia médica tem sido a base do tratamento para os pacientes com doença de coração. Um dos principais desafios no desenvolvimento de drogas é a identificação de ensaios celulares com precisão que recapitulam normal e doente fisiologia do miocárdio in vitro.
A recente convergência da biologia de células-tronco e tecnologia de engenharia de tecidos levanta novos caminhos promissores para a regeneração cardíaca. Gerando tecido miocárdico funcional a partir de uma fonte renovável paciente específico seria um grande avanço no campo. Isto permitirá o desenvolvimento de doenças específicas ensaios celulares para desenvolvimento de drogas e de descoberta e iria lançar as bases para a medicina regenerativa cardíaca. Homem-tronco embrionárias (ES) células e, mais significativamente, humanos-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células representam uma potencial fonte renovável paciente específico de células progenitoras ventriculares e miócitos ventriculares maduros. A combinação da biologia de células-tronco e as estratégias de engenharia de tecidos resolve este problema através da geração de tecido do coração funcional in vitro que pode ser utilizado no desenvolvimento de ensaios celulares para a descoberta de drogas ou em abordagens cardíacas regenerativos para o tratamento da insuficiência cardíaca avançada.
_content "> Um desafio central na regeneração cardíaca tem sido a identificação de um tipo de célula ideal. Uma vasta gama de células têm sido estudados 1, no entanto até à data, embora diferentes precursores cardiogênicos multipotentes a partir de várias fontes, foram descobertas, a identificação de uma célula fonte que atenda aos requisitos críticos, tais como comprometimento com o destino das células miogênicas, a manutenção da capacidade de expandir-se in vivo ou in vitro e da composição a um tecido funcional do miocárdio provou ser um problema central 2. Temos anteriormente descrito um sistema transgénico duplo murino que permite o isolamento de populações altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventricular (PVC) de células ES de diferenciação in vitro. Geramos um ratinho transgénico duplo novela que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed sob o controlo de um intensificador ISL1-dependente do gene e MEF2C a proteína verde fluorescente melhorada sob o controlo deo cardíacas específicas Nkx2.5 potenciador. Com base neste sistema repórter de duas cores fluorescentes, células progenitoras cardíacas primeiro e segundo campo de células ES de desenvolvimento podem ser isolados por meio de separação de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com a expressão de genes MEF2C e Nkx2.5. CVP assemelham miócitos cardíacos com base nos padrões de expressão de marcadores do miocárdio e qualidades estruturais e funcionais 3, que oferece uma grande promessa para fins regenerativos tecido cardíaco.Embora tenha havido muitos avanços no campo da engenharia de tecidos, imitando arquitetura celular nativa continua a ser um desafio fundamental. Os métodos convencionais para enfrentar este desafio são semeadura andaimes biológicos ou sintéticos com células in vitro. Devido a uma série de desvantagens dos andaimes, incluindo a degradação rápida, a estabilidade física e mecânica limitada e baixa densidade celular 1,4,5, procurou-se a engenharia de andaime, menos tecido. Altcélulas Hough cardíacos podem modificar seu microambiente local através da secreção de proteínas da matriz extracelular, eles têm uma capacidade mais limitada de se organizar para haste em forma de miócitos cardíacos, na ausência de sinais extracelulares. Assim, um modelo que fornece as células apropriadas pistas espaciais e biológicas para compor tecido miocárdico funcional é requerida. Impressão microcontact aborda este desafio, fornecendo uma técnica simples e de baixo custo para controlar com precisão a forma da célula, a organização e função 6-8, todos os quais são cruciais para a geração de tecido alinhado funcional do miocárdio. Ela inclui a utilização de microtextured polidimethilsiloxano (PDMS) selos com tamanhos característicos que vão até 2 m 9 que permitem a deposição de proteínas da matriz extracelular em substratos de PDMS em padrões precisos e, por conseguinte, afectar a adesão celular espacialmente.
Aqui, propomos combinar tecnologia de bioengenharia de tecidos com haste cell biologia para gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio. Por conseguinte, temos aqui demonstram a nossa abordagem recentemente publicado para o seguinte: (1) a geração de superfícies de proteína micropatterned em PDMS substratos por impressão microcontact para a geração de um modelo para o tecido do miocárdio alinhados, (2) o isolamento de células progenitoras cardíacas altamente purificada a partir de As células ES de diferenciação in vitro, e (3) a combinação de ambas as técnicas para gerar alinhado tecido funcional do miocárdio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, apresentamos um método para isolar populações purificadas de progenitores cardiogênico e para semente deles em substratos micropatterned fibronectina o que lhes permite alinhar e tomar uma forma haste dos miócitos cardíacos como. Organização celular normal é crítico para a função do tecido normal de 8,10, em especial para o tecido do miocárdio. Os miócitos cardíacos foram mostrados para desenvolver melhorado 11,12 mecânica e propriedades electrofisiológicas 11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura (NNIN), que é apoiada pela National Science Foundation, NSF prêmio nenhum. ECS-0335765. CNS é parte da Universidade de Harvard.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
