Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성
Summary
정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.
Abstract
고급 심장 마비가 가능한 및 / 또는 모든 기능 심장 근육 세포의 손실로 인해 발생하는, 주요 부족한 임상 도전을 나타냅니다. 최적의 약물 치료에도 불구하고, 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인을 나타냅니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 인간의 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다. 마찬가지로, 재생 심장 생물학의 주요 과제는 임상 적으로 관련성이 높은 수량의 환자 별 심장 progenitors의 식별 및 격리 중심으로. 이러한 세포는 따라서 spatially 세포 접착을 제어하는 기하학적 단서를 제공. Microcontact 인쇄는 심장의 구조 조직과 유사한 정확한 micropatterned 단백질 형태의 생성을 허용 네이티브 심장 조직 구조 유사 기능 조직으로 조립해야합니다. 여기에우리는 높은 체외, 세포 외 기질 단백질과 micropatterned 세포 성장 표면의 생성에 차별화 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 정화의 고립에 대한 우리의 접근 방식을 설명하고, 비 등방성 심근 조직에 줄기 세포 유래 심장 근육 세포의 조립.
Introduction
의료 치료의 최근 발전에도 불구하고, 고급 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인으로 남아 있습니다. 임상 증후군은 기능성 심근 조직의 손실과 영향을받는 개인의 신진 대사 요구를 충족 할 수있는 실패 심장의 이후 무능력으로부터 나옵니다. 심장이 제한된 재생 능력을 가지고 있기 때문에, autologous 심장 이식은 직접 손실 기능 심장 조직을 보충하기위한 유일한 현재 임상 적으로 받아 치료입니다. 기증 마음의 제한된 수의 및 장기 면역 억제 치료를 위해,이 치료의 넓은 확산 사용을 배제 할 필요 포함한 심장 이식의 상당 단점. 결과적으로, 의료 치료는 심장 질환 환자에 대한 치료의 의지가되는 것이었습니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다.
줄기 세포 생물학 및 조직 공학 기술의 최근 컨버전스는 심장 재생을위한 새로운 유망 도로를 발생시킵니다. 재생 환자 특정 소스에서 기능성 심근 조직을 생성하면이 분야의 주요 사전 것입니다. 이 약물 개발 및 발견을위한 질병 특정 세포 assays의 개발을 허용하고 심장 재생 의료의 기반을 마련합니다. 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 더 크게, 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포는 심실 전구 세포와 성숙 심실 근세포의 잠재적 재생 환자 특정 소스를 나타냅니다. 줄기 세포 생물학 및 조직 공학 전략의 조합은 약물 발견 또는 고급 심장 마비의 치료를위한 심장 재생 방법으로 세포 assays의 개발에 사용할 수 있습니다 체외에서 기능 심장 조직을 생성하여이 문제를 해결합니다.
_content "> 심장 재생의 중심 과제는 최적의 세포 유형의 식별되었습니다. 다양한 소스의 다른 multipotent cardiogenic 전구체가 발견되었습니다 있지만, 세포의 다양한 배열을, 그러나 지금까지 세포의 식별을 1 연구 한 예를 myogenic 세포의 운명에 대한 헌신과 같은 중요한 요구 사항을 충족 소스는 기능 심근 조직에 생체 나 생체과 구성에 확장 할 수있는 용량의 유지 보수 중심 문제가이 것으로 증명되었습니다. 우리는 이전에 두 유전자 변형 손쥐 시스템을 설명했습니다 그 높은 체외에서 차별화 ES 세포에서 헌신적 인 심실 progenitors (CVP)의 인구를 정화의 고립을 할 수 있습니다. 우리는 MEF2c 유전자의 Isl1에 의존 증강의 통제하에 dsRed 빨간색 형광 단백질을 표현하는 소설 두 유전자 변형 마우스를 생성하고 의 통제하에 강화 된 녹색 형광 단백질심장 별 Nkx2.5 증강. 이 두 색의 형광 기자 시스템, MEF2c 및 Nkx2.5 유전자의 표현에 따라 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 분리 될 수 개발 ES 세포에서 첫 번째와 두 번째 심장 필드 progenitors을 기반으로합니다. CVP는 심장 조직 재생을 위해 큰 약속을 제공하는 심근 마커 및 구조와 기능 특성 3의 표현 패턴에 따라 심장 근세포 유사.조직 공학의 분야에서 많은 발전이있었습니다했지만, 원시 세포 구조를 모방하는 것은 중요한 도전 남아있다. 이 문제를 해결하기 위해 기존의 방법은 체외에서 세포와 퍼 뜨리고 생물학적 또는 합성 공사장 공중 발판이 포함되어 있습니다. 빠른 저하, 제한된 물리적, 기계적 안정성과 낮은 세포 밀도 1,4,5 등의 공사장 공중 발판의 단점의 숫자로 인해, 우리는 비계없는 조직을 처리하려고 시도했습니다. Alt 키무릎 심장 세포는 세포 외 기질 단백질의 분비에 의해 지역 microenvironment을 수정할 수 있습니다, 그들은 세포 신호의 부재에로드 모양의 심장 근세포에 자신을 정리하는 더 제한된 용량을 갖추고 있습니다. 따라서, 기능 심근 조직을 구성하는 세포 적절한 공간 및 생물학적 단서를 제공하는 템플릿이 필요합니다. Microcontact 인쇄 정확하게 정렬 기능 심근 조직의 생성에 중요한 모든있는 세포 모양, 조직 및 기능 6-8을 제어 할 수있는 간단하고 저렴한 방법을 제공하여이 문제를 해결합니다. 그것은 정확한 패턴에 PDMS 기판에 세포 외 기질 단백질의 증착을 가능하게하므로 spatially 세포 접착에 영향을 미치는 2 μm 9 다운 이르기까지 기능 크기로 microtextured Polydimethylsiloxane (PDMS) 우표의 사용을 포함한다.
여기, 우리는 줄기 cel과 조직 생체 공학 기술을 결합하는 제안리터 생물학은 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다. 따라서, 우리는 여기에 다음에 대한 최근 게시 된 접근 방식을 보여줍니다 : (1) 정렬 심근 조직에 대한 템플릿의 생성에 대한 microcontact 인쇄에 의한 PDMS 기판에 micropatterned 단백질 표면의 생성 (2) 높은에서 심장 progenitors을 정화의 분리 ES 세포는 체외에서 차별화, 그리고 (3) 생성하는 두 기술의 결합 기능 심근 조직을 정렬.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 그들을 정렬하고 심장 myocyte 같은로드 모양을 할 수 있습니다 어떤 cardiogenic progenitors의 정화 인구를 분리하고 micropatterned Fibronectin 기판에 씨앗을에 할 수있는 방법을 제시했다. 일반 세포 조직은 심근 조직에 대한 특히 정상 조직 기능 8,10에 대한 중요합니다. 심장 근세포는 비 등방성 셀 배열을 형성 할 때 향상된 기계적 11,12 및 electrophysiological 속성 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Nanoscale 시스템을위한 센터 (CNS), 아니 NSF 상 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 국가 나노 기술 인프라 네트워크 (NNIN)의 회원에 부분에 수행되었다. ECS-0335765. CNS는 하버드 대학의 일부입니다.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
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