수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴
Summary
수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.
Abstract
빠르고, 사용하기 쉬운 저렴 세포 패터닝 기술은 세포 세포 상호 작용과 조직 엔지니어링 시스템을 공부 높은 처리량 세포 assays, 플랫폼의 미래 발전을 위해 필요합니다. 이 자세한 프로토콜은 임계 농도 위에 결합 상 별도의 때 dextran (DEX) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 biocompatible 솔루션을 사용 세포의 공동 문화를 생성하는 방법을 설명합니다. 세포는이 방법을 사용하여 구성 다양한 패턴 할 수 있습니다. 셀 제외 패턴은 기판에 DEX의 방울을 인쇄하고 PEG가 포함 된 셀의 솔루션을 다루는하여 수행 할 수 있습니다. 두 폴리머 솔루션을 사이에 형성 계면 장력은 DEX 비말의 바깥 주위에 빠지지 및 마이그레이션 assays에 사용 할 수있는 원형 개간를 형성 세포가 발생합니다. 셀 섬은 PEG 용액에 세포 풍부한 DEX 단계를 분배하거나 DEX를 덮고하여 패턴 할 수 있습니다PEG의 솔루션을 비말. 공동 문화는 DEX 섬의 패턴과 셀 제외를 조합하여 직접 형성 될 수있다. 이 방법은 수동 micropipetting 등의 액체 처리 방법, 다양한와 호환 있으며, 거의 모든 자기편 세포 유형으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
이 호환되지 않는 고분자의 솔루션은 충분히 높은 농도에서 함께 혼합 수용액 2 단계 시스템 (ATPSs)는 형식입니다. 단계 분리는 분자량과 극성 고분자의, 솔루션, 산도 및 수성 용매 1, 2의 이온 콘텐츠의 온도를 포함 다양한 요소에 의해 영향을받습니다. 별도의 두 폴리머 솔루션 선택 단계 시스템의 physiochemical 특성에 의해 결정하지만,되는 시점은 일반적으로 ATPSs는 생명 공학에 사용 할 수 있도록, 비 denaturing 조건 하에서 낮은 폴리머 농도 (20 % 이하 중량 / 중량)에 발생 응용 프로그램 3-9.
지금까지 가장 광범위하게 연구 ATPS는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) / dextran (DEX) 시스템입니다. 이 저렴하고 biocompatible 폴리머에 의해 형성 ATPS는 원래 분자 파티션 2, 10에 의해 분자의 정화에 대한 설명되었다. 파티션상 시스템에 기여하지 않은 추가 분자 또는 입자 PEG와 DEX과 혼합 할 때 발생합니다. DEX 또는 PEG 중 대한 상대적 동질성을 바탕으로 분자 또는 입자는 우선적으로 두 단계 중 하나에 또는 인터페이스에있는 것입니다. PEG / DEX ATPS의 또 다른 속성은 두 폴리머 단계 사이의 계면 장력의 존재입니다. PEG 및 DEX에 의해 형성 ATPSs은 일반적으로 기름과 물 등의 액체 – 액체 2 상 시스템보다 훨씬 낮 계면 긴장을 표시하지만, 계면 장력 세력은 여전히 바이러스, 세포와 단백질을 합산이 같은 작은 입자에 효과를 발휘 , 11-13. 포유류의 세포에 대한 해로운 영향이 내에 포함되는 경우, 높은 분자량 PEG와 DEX 소금의 생리적 농도의 존재에 낮은 농도 (5 % 이하의 중량 / 고 분자량의 폴리머 종류에 대한 중량)에서 별도의 있기 때문에, 몇 있습니다 시스템14-16.
최근 계면 특성과 ATPSs의 파티션 효과를 세포 패터닝 14, 16-20 위해 우리 실험실에 의해 적용되었습니다. 이것은 micropatterning에 의해 PEG의 존재의 세포 배양 기판에 밀도가 DEX 솔루션을 달성했습니다. 세포 PEG 단계에 통합 될 때, 그것들은 PEG / DEX 계면 장력 20 인해 DEX의 방울을 입력에서 제외됩니다. 세포 DEX 단계에서 패턴 할 때, 그것들은 계면 장력과 분할 16, 17, 19에 의해 세포 배양 기판의 표면에 유지됩니다.
세포 패터닝을위한 다른 방법 대조적으로, ATPS 세포 패터닝은 배우기 쉽습니다 만 고분자 자체, 그리고 세포 배양을 수행하고 micropipettor를 사용할 수있는 기능에 대한 기초적인 지식이 필요합니다. 세포 패터닝을위한 다른 방법은 종종 쉽게 번째로 번역되지 않은 특수 장비 및 교육을 포함전자 생명 과학. 예를 들어, 일부 방법 (microcontact 인쇄 나 잉크젯 인쇄) 간접적 이후 휴대 첨부 파일 21, 22에 대한 사이트 역할을 문화 기판에 세포 접착 분자의 패턴을 적용하여 패턴 세포. 간접적 인 접근 방법은 몇 가지 세포 유형에 대한 유용한 있지만, 사용자 기술과 패터닝 도구를 제조하는 전문 장비의 높은 수준을 필요로하고, 특정 세포 유형 / 생체 분자 패턴에 따라 특이성이 부족 할 수 있습니다. 또한, 세포는 판상 흐름 패턴, stenciling 및 잉크젯 인쇄 23-26를 포함 직접 패터닝의 방식에 의해 높은 패턴 특이성으로 증착 될 수있다. 그러나 이러한 기술은 사용자의 전문 지식과 전문 장비를 필요로하고, 인쇄 과정에서 세포가 손상 될 수 있습니다. 이러한 접근 방법은 일반적으로 생명 과학에 유용한 도구가 될 세포 패터닝을위한 세포의 정확한 패턴을 생산하지만, 비용 효과적인이어야합니다구현하기 간단한 차.
여기 우리는 이전에 출판 응용 프로그램에 설명 된 ATPSs를 사용하여 패턴 배양 한 세포를 생성하는 자세한 프로토콜을보고합니다. 만 micropipettors를 사용하여 사용자는 마이그레이션 assays에 대한 셀 제외 지역 또는 셀 섬을 생성 할 수 있습니다. 이것은 어느 DEX 단계에서 세포를 유지하거나 DEX에서 PEG 단계에 입금 셀을 제외 PEG / DEX 계면 장력에 의해 달성된다. 이 두 기본 패턴 기술을 결합함으로써, 빠르게 등 간 섬유 아세포 세포 공동 문화와 같은 세포의 공동 문화를 생성 할 수 있습니다. 패터닝 방법, ATPS 매개 변수와 예상 결과가 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATPS 셀 micropatterning 방법은 세포 배양 기술의 능력 이외의 거의 전문 지식을 필요로 신속하게 마스터 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 저렴한 신속하고 세포 유형과 문화 다양한 형식의와 호환되는지입니다. 이러한 이유로, 우리의 프로토콜은 쉽게 특히 생명 과학자, 세포 증식, 이주 및 chemotaxis, 그리고 세포 인구 중 juxtacrine 및 paracrine 상호 작용의 영향을 연구하는 사람들에 의해 채택되어야한?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JBW에 대한 :;이 작품은 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 재단, Beyster 재단, 학부 연구 기회 (UROP) ATA와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 학생 연구 휄로 십 (2,010,101,926. ID 부여없이 당선 0718128) 여름 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent | Manufacturer |
| Dextran 500,000 kDa | Pharmacosmos, Denmark |
| Polyethylene Glycol 35,000 kDa | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO |
| Hela | ATCC, Manassas, VA |
| HepG2 C3A | ATCC, Manassas, VA |
| NIH 3T3 | ATCC, Manassas, VA |
| Cell Tracker | Invitrogen, Carlsbad, CA |
| DMEM | Gibco, Carlsbad, CA |
| RPMI | Gibco, Carlsbad, CA |
| F12 | Gibco, Carlsbad, CA |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Carlsbad, CA |
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