蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する
Summary
生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。
Abstract
細胞が感知し、そのような細胞外マトリックスや成長因子などの水溶性の手がかりの糖タンパク質などの接着手がかりの高い濃度に向かって移動することができます。ここでは、ライブセルイメージングと互換性のあるマイクロ流体チャンバー内に接着剤及び水溶性の手がかりの対向するグラデーションを作成する方法を概説しています。ポリ-L-リジンおよびポリエチレングリコール（PLL-PEG）の共重合体は、カバーガラスを不動態と生体分子と細胞の非特異的吸着を防止するために採用されている。次に、マイクロコンタクトプリンティングまたはディップペンリソグラフィーは、接着手がかりとしてビオチン化ペプチドアルギニン – グリシン – アスパラギン酸（RGD）のためのポイントをアンカーとして機能するように不動態化された表面にストレプトアビジンのトラックを作成するために使用されます。マイクロ流体デバイスは、修正された表面上に配置され、ストレプトアビジントラックに接着手がかり（100％、0％、RGDにRGD）の勾配を作成するために使用されます。最後に、同じマイクロ流体デバイスは、化学誘引成功のグラデーションを作成するために使用され接着剤手がかりの勾配の反対方向に可溶手がかりとしてウシ胎児血清（FBS）、hも付きます。
Introduction
監督細胞遊走は、多くの細胞の基本的な財産であり、胚発生、感染防御、創傷治癒を含む多くの正常な生理学的プロセスの重要な側面である。加えて、細胞遊走はまた、血管疾患、腫瘍細胞の転移および慢性炎症の1,2のような多くの疾患において重要な役割を果たしている。古典的な細胞移動の状態が-偏光、突起伸展性、接着性、力発生とリア撤回の形成は-一般的に3,4を受け入れており、信号の統合が調整されることによって時空のメカニズムを解明することは、より困難になっています。
細胞外マトリックス（ECM）は、細胞接着のための基質として機能し、固有の化学的および物理的な5 6多様性を通じて、セルナビゲーション7,8のための方向手がかりを提供しています。これらの接着剤の合図9、可溶性因子10月12日に加えて、</ sup>のようなケモカインおよび増殖因子としては、化学誘引物質受容体とその下流motogenicシグナリングを介して導か細胞遊走を誘導することができる。現在、このような受容体チロシンキナーゼ（RTK）などの関与と接着受容体（ すなわち、インテグリン）または化学誘引物質受容体を介したシグナル伝達、かどうかは知られていない、支配的である。また、それは受容体系の階層は特定の細胞型であるかどうか知られています。
生細胞顕微鏡、バルクアッセイではアクセスできませんし、固定化された13,14及び可溶性手がかり15 16の勾配を生成するマイクロ流体デバイスと組み合わせることができる豊富な情報を提供します。ここで説明する方法は簡単に細胞生物学研究室（ 図1）で実施可能であることを細胞遊走のイメージングアッセイを作成するには、市販のマイクロ流体室と連携して、表面改質のためのシンプルで確立された一連の手順を利用しています。組み立てマイクロ流体デバイスは、ガラス17に匹敵すると拡散性分子の勾配は少なくとも16時間安定している光学特性を持っています。システムは、落射蛍光顕微鏡と高度な技術を使用することができます。他の走化性のセットアップ18とは異なり、このシステムは徐々に移行し、接着細胞を記録するのに適しています。重要なのは、システムがモジュール化されており、簡単に代替接着剤や水溶性遊走の手がかりと様々な種類の細胞の検査の導入が可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、化学的に修飾された表面および細胞遊走に対する誘引物質勾配の影響を調査するために、市販のマイクロ流体デバイス（Ibidiからスティッキスライド走3D）を使用しました 。勾配は、チャネルの長さに沿って拡散することによって確立されるので、この設定では、マイクロ流体の流れを必要としません。流れは差ような安定した接着斑と小焦点複合体と?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、オーストラリアの研究評議会と国民健康オーストラリアの医学研究評議会から資金を認め、また感謝したい マイクロコンタクトプリント用のSU-8のマスターのためにオーストラリア国立加工施設。 SHNは、高等教育マレーシアとマレーシア科学大学省によってサポートされています。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
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