Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy
Summary
En fremgangsmåde til samling af lim og opløselige gradienter i en mikroskopi kammer til levende celler migrationsundersøgelser er beskrevet. Den konstruerede miljø kombinerer antifouling overflader og klæbende spor med løsning gradienter og derfor tillader en at bestemme den relative betydning af vejledning cues.
Abstract
Celler kan mærke og migrere mod højere koncentrationer af adhæsive signaler som glycoproteinerne i den ekstracellulære matrix og opløselige signaler som vækstfaktorer. Her har vi beskrive en fremgangsmåde til at skabe modstående gradienter af klæbemiddel og opløselige signaler i en mikrofluid kammer, som er kompatibel med levende celler. En copolymer af poly-L-lysin og polyethylenglycol (PLL-PEG) anvendes til at passivere dækglas og forhindre ikke-specifik adsorption af biomolekyler og celler. Dernæst microcontact trykning eller dip pen litografi anvendes til at skabe spor af streptavidin på de passiverede overflader for at tjene som forankringspunkter for det biotinylerede peptid arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) som klæbemiddel stikord. En mikrofluid anordning anbringes på den modificerede overflade og anvendes til at skabe gradient af adhæsive signaler (100% RGD til 0% RGD) på de streptavidin-spor. Endelig er den samme mikrofluid anordning, der anvendes til at skabe en gradient af en kemoattraktant such som føtalt bovint serum (FBS), som det opløselige udgangspunkt i den modsatte retning af gradienten af klæbende signaler.
Introduction
Instrueret cellemigration er en fundamental egenskab af mange celler og er et centralt element i mange normale fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, forsvar mod infektioner og sårheling. Desuden cellemigration spiller en fremtrædende rolle i mange sygdomme, såsom vaskulær sygdom, tumorcellemetastase og kronisk inflammation 1,2. Mens de klassiske tilstande af cellemigrering – polarisering, fremspring forlængelse, dannelse af vedhæftning, force generation og bageste tilbagetrækning – generelt accepteres 3,4, har udredning af Spatiotemporal mekanismer, som signal integration er koordineret været mere udfordrende.
Den ekstracellulære matrix (ECM) tjener som et substrat for celleadhæsion, og gennem iboende kemiske 5 og fysiske 6 mangfoldighed, retningsbestemte signaler for celle navigation 7,8 tilvejebringer. Ud over disse adhæsive signaler 9, opløselige faktorer 10-12 </ Sup> såsom kemokiner og vækstfaktorer kan fremkalde rettet cellevandring gennem kemotiltrækkende receptorer og deres downstream motogenic signalsystemer. For øjeblikket vides det ikke, om engagement og signalering via adhæsionsreceptorer (dvs. integriner) eller kemotiltrækkende receptorer, såsom receptor (RTK), er dominerende. Det er heller ikke kendt, om hierarkier af receptor-systemer er celletypespecifik.
Live-celle mikroskopi giver et væld af oplysninger, som ikke er tilgængelig i bulk assays og kan kombineres med mikrofluidenheder at generere gradienter af immobiliserede 13,14 og opløselige signaler 15 16. Den her beskrevne metode anvender en række simple og etablerede fremgangsmåde til overflademodifikation sammen med et kommercielt tilgængeligt mikrofluid kammer til at skabe et billeddannende analyse for cellemigration, som nemt kan implementeres i en cellebiologi laboratorium (figur 1). Den samledemikrofluid anordning har optiske egenskaber, der er sammenlignelige med glas 17 og gradienter af diffunderbare molekyler er stabile i mindst 16 timer. Systemet kan anvendes til epifluorescens og avancerede mikroskopi teknikker. I modsætning til andre kemotaxi opsætninger 18, er dette system egnet til optagelse langsomt migrerer, adhærente celler. Vigtigt er det, at systemet er modulopbygget og let tillader indføringen af alternative klæbemiddel eller opløselige migration køer og undersøgelse af forskellige celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, brugte vi en kommercielt tilgængelig mikrofluid enhed (klæbrig-Slide Kemotaksi 3D fra Ibidi) til at undersøge virkningerne af kemisk modificerede overflader og kemotiltrækkende gradienter på cellemigrering. Denne mikrofluid opsætning kræver ikke strømning, fordi gradienten etableres ved diffusion langs længden af kanalen. Dette er vigtigt, fordi flow differentielt kunne påvirke langsomt migrerende celler såsom fibroblaster, som danner stabile fokale adhæsioner og hurtigt mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtte fra Australian Research Council og National Health og Medical Research Council i Australien, og også gerne takke Australian National Fabrication facilitet for SU-8 mester for microcontact udskrivning. SHN er støttet af Ministeriet for Videregående Uddannelser Malaysia og Universiti Sains Malaysia.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
