Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d'imagerie par microscopie à fluorescence
Summary
Une méthode pour l'assemblage des gradients adhésives et soluble dans une chambre microscopique direct des études sur la migration des cellules est décrite. L'environnement technique combine des surfaces adhésives anti-salissures et les pistes de solutions avec des dégradés et permet donc de déterminer l'importance relative des signaux de guidage.
Abstract
Cellules peut détecter et à migrer vers des concentrations plus élevées de signaux adhésives telles que les glycoprotéines de la matrice extracellulaire et des signaux solubles tels que les facteurs de croissance. Ici, nous décrivons une méthode pour créer des gradients opposés de repères adhésifs et soluble dans une chambre microfluidique, qui est compatible avec l'imagerie de cellules vivantes. Un copolymère de poly-L-lysine et de polyéthylène glycol (PEG-PLL) est employée pour passiver des lamelles de verre et empêcher l'adsorption non spécifique de biomolécules et de cellules. Suivant l'impression par microcontact, ou immersion lithographie stylo sont utilisés pour créer des voies de la streptavidine sur les surfaces passivées à servir de points d'ancrage pour le peptide biotinylé arginine-glycine-acide aspartique (RGD) comme le repère adhésif. Un dispositif microfluidique est placé sur la surface modifiée et utilisée pour créer le gradient de signaux adhésives (100% RGD RGD à 0%) sur les pistes de streptavidine. Enfin, le dispositif microfluidique même est utilisé pour créer un dégradé de succès chimiotactiqueh comme sérum de veau foetal (FBS), que le signal soluble dans le sens inverse du gradient d'indices adhésives.
Introduction
La migration cellulaire dirigée est une propriété fondamentale de nombreuses cellules et est un aspect clé de nombreux processus physiologiques normaux, y compris le développement embryonnaire, de la défense contre l'infection et la cicatrisation. En outre, la migration cellulaire joue également un rôle important dans de nombreuses maladies telles que les maladies vasculaires, métastase des cellules tumorales et de 1,2 inflammation chronique. Alors que les états classiques de la migration cellulaire – polarisation, de vulgarisation, de formation saillie de l'adhérence, la force et la rétraction arrière – sont généralement acceptés 3,4, l'élucidation des mécanismes par lesquels l'intégration spatio-temporelle du signal est coordonné a été plus difficile.
La matrice extracellulaire (MEC) sert de substrat pour l'adhésion cellulaire, et par l'intermédiaire chimique et physique inhérente 5 6 diversité, fournit des signaux de direction pour la navigation cellule 7,8. En plus de ces indices adhésives 9, les facteurs solubles 10-12 </ Sup> tels que les chimiokines et des facteurs de croissance peut induire la migration cellulaire dirigée par les récepteurs chimiotactiques et de leur signalisation en aval motogenic. À l'heure actuelle, on ne sait pas si l'engagement et de la signalisation par les récepteurs d'adhésion (intégrines par exemple) ou des récepteurs chimiotactiques tels que récepteur tyrosine kinase (RTK), sont dominants. Il n'est pas connu si les hiérarchies de systèmes de récepteurs sont spécifiques de type cellulaire.
Microscopie de cellules vivantes donne une foule d'informations qui n'est pas accessible dans des essais en vrac et peuvent être combinés avec des dispositifs microfluidiques pour générer des gradients de 13,14 immobilisés indices et solubles 15 16. La méthode décrite ici utilise une série d'étapes simples et établies pour la modification de surface en conjonction avec une chambre de disponible dans le commerce microfluidique pour créer un test d'imagerie pour la migration des cellules qui peuvent être facilement mises en œuvre dans un laboratoire de biologie cellulaire (Figure 1). L'assemblagedispositif microfluidique a des qualités optiques comparables à verre 17 et les gradients de molécules diffusibles sont stables pendant au moins 16 h. Le système peut être utilisé pour des techniques de microscopie à épifluorescence et avancé. Contrairement à d'autres configurations de chimiotaxie 18, ce système est idéal pour enregistrer lentement migrateurs, les cellules adhérentes. Surtout, le système est modulaire et permet facilement la mise en place de l'adhésif de remplacement ou des indices de migration solubles et l'examen des différents types cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif microfluidique disponible dans le commerce (sticky-Slide chimiotactisme 3D à partir de Ibidi) pour étudier les effets des surfaces chimiquement modifiées et les gradients chimiotactiques sur la migration des cellules. Cette configuration ne nécessite pas de microfluidique écoulement car le gradient est établi par diffusion le long de la longueur du canal. Ceci est important parce que la circulation pourrait affecter différemment les cellules migrent …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le financement de l'Australian Research Council et la Santé nationale et du Medical Research Council de l'Australie et également à remercier l' Facilité de fabrication australienne nationale pour la SU-8 maître pour l'impression par microcontact. SHN est soutenu par le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Malaisie Universiti Sains Malaysia.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
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