יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Summary
שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.
Abstract
תאים יכולים לחוש ולהעביר לריכוזים גבוהים יותר של רמזים דבקים כגון גליקופרוטאינים של מטריקס ורמזים מסיסים כגון גורמי גדילה. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת שיפועים מנוגדים של רמזים דבקים ומסיסים בתא microfluidic, אשר תואם עם הדמית תא חייה. קופולימר של פולי-L-ליזין ופוליאתילן גליקול (PLL-PEG) הוא מועסק passivate coverslips זכוכית ולמנוע ספיחה הלא ספציפית של ביומולקולות ותאים. , הדפסת microcontact הבאה או לטבול יתוגרפיה עט המשמשת ליצירת רצועות של streptavidin על משטחי פסיבציה לשמש כעיגון נקודות לפפטיד החומצה ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) biotinylated כמקל דבק. מכשיר microfluidic ממוקם על פני השטח השונים ומשמש ליצירה הדרגתית של רמזים דבקים (100% RGD לRGD 0%) על מסילות streptavidin. לבסוף, באותו המכשיר microfluidic משמש ליצירת שיפוע suc chemoattractantח כסרום עוברי שור (FBS), כאות המסיסה בכיוון ההפוך של השיפוע של רמזים דבקים.
Introduction
נדידת תאי בימוי היא מאפיין בסיסי של תאים רבים והיא היבט מרכזי של תהליכים פיסיולוגיים רבים נורמלים, כולל התפתחות עוברית, הגנה מפני זיהומים וריפוי פצעים. בנוסף, נדידת תאים גם ממלאת תפקיד מרכזי במחלות רבות כגון מחלות לב וכלי דם, גרורות של תאים סרטניים ו1,2 דלקת כרונית. בעוד המדינות הקלסיות של נדידת תאים – הקיטוב, מאריך בליטה, היווצרות הידבקות, דור כוח והנסיגה אחורית – מתקבלות בדרך 3,4, הבהרת מנגנוני חלל ובזמן שבו שילוב האות תואם כבר יותר מאתגר.
מטריקס (ECM) משמש כמצע להדבקת תא, ובכימי גלומים 5 ו 6 גיוון פיזי, מספק רמזים כיוונית לתא ניווט 7,8. בנוסף לרמזים האלה דבקים 9, גורמים מסיסים 10-12 </ Sup> כגון כמוקינים וגורמי גדילה יכולה לגרום לנדידת תאים נוהל באמצעות קולטנים chemoattractant ואיתות motogenic מורד הזרם שלהם. נכון לעכשיו, לא ידוע האם התקשרות ואיתות דרך הקולטנים הידבקות (כלומר integrins) או קולטנים chemoattractant, כגון טירוזין קינאז רצפטור (RTK), הן דומיננטית. זה גם לא ידוע אם היררכיות של מערכות רצפטור הן ספציפיות סוג תא.
מיקרוסקופיה תא חייה מעניקה שפע של מידע שאינו נגיש במבחנים בתפזורת וניתן בשילוב עם מכשירי microfluidic לייצר גרדיאנטים של רמזים משותקים 13,14 ומסיסים 15 16. השיטה המתוארת כאן מנצלת סדרה של צעדים פשוטים ומקובלים לשינוי פני שטח בשיתוף עם קאמרי microfluidic זמינה מסחרי כדי ליצור assay הדמיה לנדידת תאים שיכול בקלות להיות מיושמים במעבדת ביולוגיה של תא (איור 1). התאסףמכשיר microfluidic יש איכויות אופטיות הניתנות להשוואה לזכוכית 17 והשיפועים של מולקולות diffusible הם יציבים במשך לפחות 16 שעות. המערכת יכולה לשמש לשיטות מיקרוסקופיה epifluorescence ומתקדמות. בניגוד setups Chemotaxis האחר 18, מערכת זו היא מתאימה להקלטה נודדת לאט תאים, נדבק. חשוב לציין, המערכת היא מודולרית, ומאפשרת בקלות את ההקדמה של דבק חלופי או רמזי הגירה מסיסים ובחינה של סוגי תאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו משמשים מכשיר microfluidic זמין מסחרי (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) כדי לחקור את ההשפעות של משטחי שינוי כימי והדרגות chemoattractant על נדידת תאים. התקנת microfluidic זה אינה דורשת זרימה בגלל השיפוע הוא הוקם על ידי דיפוזיה לאורך הערוץ. זה חשוב כי תזרים יכול להשפי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
החוקרים מכירים במימון מהמועצה למחקר האוסטרלית והבריאות הלאומיות ומועצה למחקר הרפואי של אוסטרליה וגם רוצים להודות המתקן הלאומי באוסטרליה ייצור עבור SU-8 האב להדפסת microcontact. SHN נתמך על ידי משרד חינוך הגבוהה למלזיה וUniversiti Sains מלזיה.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
