प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सेल प्रवासन के लिए चिपकने वाला और घुलनशील Gradients बनाना

Summary

जीना सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक माइक्रोस्कोपी कक्ष में घुलनशील चिपकने वाला और gradients की विधानसभा के लिए एक विधि का वर्णन है. इंजीनियर पर्यावरण समाधान gradients के साथ antifouling सतहों और चिपकने वाला पटरियों को जोड़ती है और इसलिए एक मार्गदर्शन cues के रिश्तेदार महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

कक्ष भावना और कोशिकी मैट्रिक्स और विकास कारकों जैसे घुलनशील संकेत के glycoproteins जैसे चिपकने वाला संकेत के उच्च सांद्रता की ओर पलायन कर सकते हैं. यहाँ, हम microfluidic एक कक्ष है, जो जीना सेल इमेजिंग के साथ संगत है में घुलनशील चिपकने वाला और संकेत के का विरोध gradients बनाने के लिए एक विधि की रूपरेखा. पाली एल lysine और polyethylene glycol (पीएलएल खूंटी) के एक copolymer गिलास coverslips passivate और गैर विशिष्ट biomolecules और कोशिकाओं के सोखना को रोकने के लिए कार्यरत है. अगला, microcontact मुद्रण या डुबकी कलम लिथोग्राफी streptavidin passivated सतहों पर पटरियों बनाने के लिए चिपकने वाला संकेत के रूप biotinylated पेप्टाइड arginine-glycine एसपारटिक एसिड (RGD) के लिए अंक के प्रस्तोता के रूप में सेवा करने के लिए किया जाता है. एक microfluidic युक्ति संशोधित सतह पर रखा जाता है और streptavidin पटरियों पर चिपकने के संकेत (100% 0% RGD RGD) की ढाल बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, एक ही microfluidic डिवाइस एक chemoattractant सफलता की एक ढाल बनाने के लिए प्रयोग किया जाता हैभ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) चिपकने cues के ढाल के विपरीत दिशा में घुलनशील क्यू के रूप में, के रूप में ज.

Introduction

निर्देशित सेल प्रवास कई कोशिकाओं की एक मौलिक संपत्ति है और कई भ्रूण के विकास, संक्रमण के खिलाफ रक्षा और घाव भरने सहित सामान्य शारीरिक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण पहलू है. इसके अलावा, सेल प्रवास भी रोग, ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस और जीर्ण सूजन ^{1,2 के} रूप में कई रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. जबकि सेल प्रवास के शास्त्रीय राज्यों ध्रुवीकरण, फलाव विस्तार, आसंजन, बल पीढ़ी और रियर त्याग के गठन ^3,4 – आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं, spatiotemporal तंत्र है जिसके द्वारा संकेत एकीकरण समन्वित है की व्याख्या और अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है.

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोशिका आसंजन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, और ⁵ निहित रासायनिक और भौतिक ⁶ विविधता के माध्यम से, सेल ^7,8 नेविगेशन के लिए दिशात्मक संकेत प्रदान करता है. इन चिपकने वाला ⁹ संकेत, घुलनशील कारकों ^10-12 के अलावा ^</> Chemokines और वृद्धि कारकों के रूप में समर्थन chemoattractant रिसेप्टर्स और उनके नीचे की ओर motogenic सिगनल के माध्यम से निर्देशित सेल प्रवास के लिए प्रेरित कर सकते हैं. वर्तमान में, यह ज्ञात नहीं है कि क्या सगाई और आसंजन (यानी integrins) रिसेप्टर्स या chemoattractant रिसेप्टर्स, रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK) के रूप में के माध्यम से संकेत, प्रमुख हैं. न ही यह जाना जाता है कि रिसेप्टर प्रणालियों के पदानुक्रम सेल प्रकार विशिष्ट हैं.

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी जानकारी का खजाना है कि थोक assays में सुलभ नहीं है और microfluidic उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है immobilized ^13,14 और घुलनशील ^{16 15} cues के gradients उत्पन्न करने देता है. यहाँ वर्णित विधि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic सेल प्रवास है कि आसानी से एक कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशाला (1 चित्रा) में लागू किया जा सकता है के लिए एक इमेजिंग परख के लिए बनाने कक्ष के साथ संयोजन के रूप में सतह संशोधन के लिए सरल और स्थापित कदम की एक श्रृंखला का उपयोग किया जाता है. इकट्ठेयुक्ति microfluidic ऑप्टिकल गुण है कि ¹⁷ गिलास तुलना कर रहे हैं और कम से कम 16 घंटे के लिए diffusible अणुओं की gradients स्थिर रहे हैं. प्रणाली epifluorescence माइक्रोस्कोपी और उन्नत तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य chemotaxis setups ^{18 के} विपरीत, इस सिस्टम धीरे धीरे पलायन, पक्षपाती कोशिकाओं रिकॉर्डिंग करने के लिए उपयुक्त है. महत्वपूर्ण बात यह प्रणाली है, मॉड्यूलर और आसानी से वैकल्पिक चिपकने वाला या घुलनशील प्रवास cues और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की परीक्षा की शुरूआत की अनुमति देता है.

Protocol

1. PLL-खूंटी बायोटिन साथ ग्लास Coverslips Passivation इस कदम के लिए सतह passivate ताकि कोशिकाओं का पालन करना और कांच coverslip पर विशिष्ट क्षेत्रों कि microcontract (चरण 2 3a) मुद्रण या डुबकी कलम लिथोग्राफी (3b चरण) के साथ बनाया जाता है प…

Representative Results

समझ कैसे सेल प्रवासी संकेतों 25 एकीकृत करने के लिए, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी है कि प्रतिस्पर्धा चिपकने वाला और घुलनशील gradients (1 चित्रा) के साथ एक वातावरण में पलायन के साथ एक विधि छवि कोशिकाओ?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic युक्ति का इस्तेमाल किया (Ibidi से चिपचिपा स्लाइड chemotaxis ^{3 डी)} रासायनिक संशोधित सतहों और सेल प्रवास पर chemoattractant gradients के प्रभाव का अध्ययन. इस microfluidic सेटअप प्रव?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Coverglass staining outfits	Thomas Scientific	8542 E40	Coverslip rack
Oven	Binder		ED 53 series
Silicon wafer	Silicon Quest	708-007	Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist	Gersteltec Sarl
SU-8 developer	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent	Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer	Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	1 mg/ml in PBS
Fluorescein	Sigma	46955	1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein	Invitrogen	B-1370	0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD	GenScript	SC1208	0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D	Ibidi	80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip	Greiner Bio-One	739261
Vaseline	Sigma	16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μm cantilever	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin	Fabrice Cordelières		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html