Fremgangsmåte for sammenstilling av klebende og løselig gradienter i en mikroskopi kammer for live celle migrasjon studier er beskrevet. De utviklet miljø kombinerer bunnstoff overflater og lim spor med løsning gradienter og derfor gjør det mulig å bestemme den relative betydningen av veiledning signaler.
Celler kan føle og migrere mot høyere konsentrasjoner av selvklebende signaler som de glykoproteiner av ekstracellulær matriks og løselige signaler som vekstfaktorer. Her, skissere vi en fremgangsmåte for å lage motstridende gradienter av klebende og løselig pekepinner i en microfluidic kammer, som er kompatibel med levende celle bildebehandling. En kopolymer av poly-L-lysin og polyetylenglykol (PLL-PEG) er anvendt for å passivere glass dekkglass og hindre ikke-spesifikk adsorpsjon av biomolekyler og celler. Neste, microcontact utskrift eller dip penn litografi er brukt til å lage sporene streptavidin på passiverte overflater for å tjene som forankringspunkter for biotinylert peptid arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) som limet stikkordet. En microfluidic enheten er plassert på den modifiserte overflaten og brukes til å lage gradient av selvklebende pekepinner (100% RGD til 0% RGD) på streptavidin spor. Endelig, er det samme microfluidic enhet som brukes til å opprette en gradient av en kjemotiltrekkende sukh som føtalt bovint serum (FBS), som det løselige stikkordet i motsatt retning av gradienten av selvklebende signaler.
Rettet celle migrasjon er en grunnleggende egenskap av mange celler og er en viktig del av mange normale fysiologiske prosesser, herunder embryoutvikling, forsvar mot infeksjoner og sårheling. I tillegg spiller cellemigrering også en fremtredende rolle i mange sykdommer som vaskulær sykdom, tumorcelle metastasering og kronisk inflammasjon 1,2. Mens de klassiske statene celle migrasjon – polarisering, protrusion forlengelse, dannelse av vedheft, kraft generasjon og bak tilbaketrekking – er generelt akseptert 3,4, har klarlegging av Spatiotemporal mekanismer som signal integrasjon er koordinert vært mer utfordrende.
Den ekstracellulære matriks (ECM) fungerer som et substrat for celleadhesjon, og gjennom iboende kjemisk 5 og fysiske 6 mangfold, gir retningsbestemte signaler for celle navigering 7,8. I tillegg til disse lim pekepinner 9, oppløselige faktorer 10-12 </ Sup> for eksempel chemokines og vekstfaktorer kan indusere rettet celle migrasjon gjennom kjemotiltrekkende reseptorer og deres nedstrøms motogenic signalveier. Foreløpig er det ikke kjent om engasjement og signalering gjennom adhesjonsreseptorer (dvs. integriner) eller kjemotiltrekkende reseptorer som reseptor tyrosinkinase (RTK) er dominerende. Det er heller ikke kjent om hierarkier av reseptorsystemer er celletype bestemt.
Levende celle mikroskopi gir et vell av informasjon som ikke er tilgjengelig i bulk analyser og kan kombineres med microfluidic enheter å generere graderinger av immobilisert 13,14 og løselig pekepinner 15 16. Metoden beskrevet her anvender en serie enkle og etablerte trinn for overflatemodifisering sammen med et kommersielt tilgjengelig microfluidic kammer for å opprette en avbildning assay for celle migrasjon som lett kan gjennomføres på en cellebiologi laboratorium (figur 1). Den sammensattemicrofluidic enhet har optiske egenskaper som er sammenlignbare med glass 17 og gradienter av diffusjonsevne molekyler er stabil i minst 16 timer. Systemet kan brukes til epifluorescence og avanserte mikroskopi teknikker. I motsetning til andre chemotaxis oppsett 18, er dette systemet egnet for opptak langsomt migrere, adherente celler. Viktigere er systemet modulært og lett tillater innføring av alternative klebemiddel eller oppløselige migrasjon signaler og undersøkelse av forskjellige celletyper.
I denne protokollen, brukte vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet (klebrig-Slide chemotaxis 3D fra Ibidi) for å studere effektene av kjemisk modifiserte overflater og kjemotiltrekkende graderinger på celle migrasjon. Dette microfluidic oppsettet krever ikke flyt fordi gradienten er etablert ved diffusjon langs lengden av kanalen. Dette er viktig fordi strømning kunne differensielt påvirke langsomt migrerende celler slik som fibroblaster som danner stabile fokale adhesjoner og raske migrerende …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner støtte fra den australske Forskningsrådet og National Health and Medical Research Council of Australia og liker også å takke Australian National Fabrication Facility for SU-8 master for microcontact utskrift. SHN støttes av departementet for høyere utdanning Malaysia og Universiti Sains Malaysia.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
Oven | Binder | ED 53 series | |
Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
Vaseline | Sigma | 16415 | |
Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |