Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Summary

Fremgangsmåte for sammenstilling av klebende og løselig gradienter i en mikroskopi kammer for live celle migrasjon studier er beskrevet. De utviklet miljø kombinerer bunnstoff overflater og lim spor med løsning gradienter og derfor gjør det mulig å bestemme den relative betydningen av veiledning signaler.

Abstract

Celler kan føle og migrere mot høyere konsentrasjoner av selvklebende signaler som de glykoproteiner av ekstracellulær matriks og løselige signaler som vekstfaktorer. Her, skissere vi en fremgangsmåte for å lage motstridende gradienter av klebende og løselig pekepinner i en microfluidic kammer, som er kompatibel med levende celle bildebehandling. En kopolymer av poly-L-lysin og polyetylenglykol (PLL-PEG) er anvendt for å passivere glass dekkglass og hindre ikke-spesifikk adsorpsjon av biomolekyler og celler. Neste, microcontact utskrift eller dip penn litografi er brukt til å lage sporene streptavidin på passiverte overflater for å tjene som forankringspunkter for biotinylert peptid arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) som limet stikkordet. En microfluidic enheten er plassert på den modifiserte overflaten og brukes til å lage gradient av selvklebende pekepinner (100% RGD til 0% RGD) på streptavidin spor. Endelig, er det samme microfluidic enhet som brukes til å opprette en gradient av en kjemotiltrekkende sukh som føtalt bovint serum (FBS), som det løselige stikkordet i motsatt retning av gradienten av selvklebende signaler.

Introduction

Rettet celle migrasjon er en grunnleggende egenskap av mange celler og er en viktig del av mange normale fysiologiske prosesser, herunder embryoutvikling, forsvar mot infeksjoner og sårheling. I tillegg spiller cellemigrering også en fremtredende rolle i mange sykdommer som vaskulær sykdom, tumorcelle metastasering og kronisk inflammasjon ^1,2. Mens de klassiske statene celle migrasjon – polarisering, protrusion forlengelse, dannelse av vedheft, kraft generasjon og bak tilbaketrekking – er generelt akseptert ^3,4, har klarlegging av Spatiotemporal mekanismer som signal integrasjon er koordinert vært mer utfordrende.

Den ekstracellulære matriks (ECM) fungerer som et substrat for celleadhesjon, og gjennom iboende kjemisk ⁵ og fysiske ⁶ mangfold, gir retningsbestemte signaler for celle navigering ^7,8. I tillegg til disse lim pekepinner ^9, oppløselige faktorer ^{10-12 <}/ Sup> for eksempel chemokines og vekstfaktorer kan indusere rettet celle migrasjon gjennom kjemotiltrekkende reseptorer og deres nedstrøms motogenic signalveier. Foreløpig er det ikke kjent om engasjement og signalering gjennom adhesjonsreseptorer (dvs. integriner) eller kjemotiltrekkende reseptorer som reseptor tyrosinkinase (RTK) er dominerende. Det er heller ikke kjent om hierarkier av reseptorsystemer er celletype bestemt.

Levende celle mikroskopi gir et vell av informasjon som ikke er tilgjengelig i bulk analyser og kan kombineres med microfluidic enheter å generere graderinger av immobilisert ^13,14 og løselig pekepinner ^{15 16.} Metoden beskrevet her anvender en serie enkle og etablerte trinn for overflatemodifisering sammen med et kommersielt tilgjengelig microfluidic kammer for å opprette en avbildning assay for celle migrasjon som lett kan gjennomføres på en cellebiologi laboratorium (figur 1). Den sammensattemicrofluidic enhet har optiske egenskaper som er sammenlignbare med glass ¹⁷ og gradienter av diffusjonsevne molekyler er stabil i minst 16 timer. Systemet kan brukes til epifluorescence og avanserte mikroskopi teknikker. I motsetning til andre chemotaxis oppsett ^18, er dette systemet egnet for opptak langsomt migrere, adherente celler. Viktigere er systemet modulært og lett tillater innføring av alternative klebemiddel eller oppløselige migrasjon signaler og undersøkelse av forskjellige celletyper.

Protocol

1. Passivisering av Glass Dekkglass med PLL-PEG-biotin Dette trinnet er utformet for å passivere overflaten slik at cellene fester seg og migrere bort bestemte områder på dekkglass som opprettes med microcontract trykkteknikker (Trinn 2-3a) eller dip penn litografi (Trinn 3b). For passivering, er en co-polymer av poly-L-lysin (PLL) og polyetylenglykol (PEG) som brukes i hvilken 20% av PEG molekyler blir podet til biotin (PLL-PEG-biotin). Å rengjøre glass dekkglass (18 mm x 18…

Representative Results

For å forstå hvordan celle integrere trekkende signaler 25, har vi utviklet en metode for å bildet celler med fluorescens mikroskopi som vandrer i et miljø med konkurrerende lim og løselig gradienter (figur 1). Selvklebende spor som inneholdt fluorescerende streptavidin og biotinylert RGD ble opprettet med microcontact trykte spor og dip penn litografi (figur 2). Vellykket microcontact trykkteknikker indikeres av linje profilen av fluorescensintensiteten tvers sporene de…

Discussion

I denne protokollen, brukte vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet (klebrig-Slide chemotaxis ^3D fra Ibidi) for å studere effektene av kjemisk modifiserte overflater og kjemotiltrekkende graderinger på celle migrasjon. Dette microfluidic oppsettet krever ikke flyt fordi gradienten er etablert ved diffusjon langs lengden av kanalen. Dette er viktig fordi strømning kunne differensielt påvirke langsomt migrerende celler slik som fibroblaster som danner stabile fokale adhesjoner og raske migrerende …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Coverglass staining outfits	Thomas Scientific	8542 E40	Coverslip rack
Oven	Binder		ED 53 series
Silicon wafer	Silicon Quest	708-007	Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist	Gersteltec Sarl
SU-8 developer	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent	Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer	Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	1 mg/ml in PBS
Fluorescein	Sigma	46955	1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein	Invitrogen	B-1370	0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD	GenScript	SC1208	0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D	Ibidi	80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip	Greiner Bio-One	739261
Vaseline	Sigma	16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μm cantilever	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin	Fabrice Cordelières		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html