Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência
Summary
Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.
Abstract
As células podem detectar e migram para as concentrações mais elevadas de pistas adesivas, tais como as glicoproteínas da matriz extracelular e as pistas solúveis, tais como factores de crescimento. Aqui, descrevem um método para criar gradientes opostos de pistas adesivas e solúvel em uma câmara de microfluidos, que é compatível com imagens de células vivas. Um copolímero de ácido poli-L-lisina e o polietileno glicol (PEG-PLL) é empregada para passivar lamelas de vidro e prevenir a adsorção não especifica de biomoléculas e células. Microcontact impressão seguinte, ou litografia dip caneta são usados para criar as faixas de estreptavidina nas superfícies passivadas para servir como pontos de fixação para o péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como a pista adesiva. Um dispositivo de microfluidos é colocada sobre a superfície modificada e usados para criar o gradiente de pistas adesivas (100% RGD a RGD 0%) nas faixas de estreptavidina. Finalmente, o mesmo dispositivo de microfluidos é usado para criar um gradiente de uma suc chemoattractanth como soro fetal bovino (FBS), como o cue solúvel na direcção oposta do gradiente de pistas adesivas.
Introduction
Migração dirigida de células é uma propriedade fundamental de muitas células e é um aspecto-chave de muitos processos fisiológicos normais, incluindo o desenvolvimento embrionário, a defesa contra a infecção e cicatrização de feridas. Além disso, a migração de células também desempenha um papel importante em várias doenças tais como a doença vascular, metástase de células tumorais e de 1,2 a inflamação crónica. Embora os estados clássicos da migração das células – polarização, extensão saliência, a formação de aderência, a geração de forças de retracção e de trás – são geralmente aceites 3,4, a elucidação dos mecanismos de espaço-temporais, que por integração do sinal é coordenado tem sido mais difícil.
A matriz extracelular (ECM), que serve como um substrato para a adesão celular, e através de química inerente 5 e 6 diversidade física, fornece indicações direccionais para navegação célula 7,8. Além destas pistas adesivas 9, factores solúveis 10-12 </ Sup>, como quimiocinas e fatores de crescimento pode induzir a migração de células por meio de receptores dirigido quimioatratantes e sua sinalização a jusante motogenic. Actualmente, não se sabe se o acoplamento e a sinalização através de receptores de adesão (integrinas, por exemplo) ou de receptores quimiotáticas, tais como receptor da tirosina quinase (RTK), são dominantes. Também não é conhecido se as hierarquias de sistemas receptores são específicos do tipo de célula.
Microscopia de células vivas dá uma riqueza de informações que não é acessível em ensaios a granel e pode ser combinado com dispositivos microfluídicos para gerar gradientes de imobilizados pistas 13,14 e solúvel 15 16. O método descrito aqui utiliza uma série de passos simples e bem estabelecida para a modificação de superfície em conjunto com uma câmara comercialmente disponível microfluídico para criar uma imagem de ensaio para a migração de células que podem ser facilmente implementados em um laboratório de biologia das células (Figura 1). O montadodispositivo micro tem qualidades ópticas que são comparáveis aos do vidro 17 e os gradientes de moléculas difusíveis são estáveis durante pelo menos 16 horas. O sistema pode ser usado para as técnicas de microscopia de epifluorescência e avançado. Ao contrário de outras configurações de quimiotaxia 18, este sistema é adequado para a gravação lentamente migram, as células aderentes. É importante notar que o sistema é modular e facilmente permite a introdução de adesivo alternativa ou pistas de migração solúveis e análise de vários tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, foi utilizado um dispositivo disponível comercialmente microfluídicos (sticky Slide-Quimiotaxia 3D a partir de Ibidi) para estudar os efeitos de superfícies quimicamente modificados e gradientes quimioatratantes sobre a migração celular. Esta instalação não requer microfluídico porque o gradiente de fluxo é estabelecido por difusão ao longo do comprimento do canal. Isto é importante porque o fluxo poderia afectar diferencialmente células migram lentamente, tais como fibroblastos,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o financiamento do Australian Research Council e National Health and Medical Research Council da Austrália, e também gostaria de agradecer a Australian instalação de fabricação nacional para o SU-8 mestre para a impressão microcontact. SHN é apoiado pelo Ministério do Ensino Superior Malásia e Sains Universiti Malaysia.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
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