Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии
Summary
Метод для сборки клеем и растворимых градиентов в камере для микроскопии живых исследований миграции клеток описано. Инженерии окружающей среды сочетает в себе обрастания поверхности и клея треки с решением градиенты и, следовательно, позволяет определить относительную важность указания сигналы.
Abstract
Клетки могут чувствовать и мигрировать в сторону более высоких концентраций клей сигналы, такие как гликопротеины внеклеточного матрикса и растворимых сигналы, такие как факторы роста. Здесь мы опишем метод, чтобы создать противоположные градиенты клея и растворимых сигналы в микрофлюидных камеры, которая совместима с изображений живых клеток. Сополимер поли-L-лизин и полиэтиленгликоля (PEG-PLL) используется для пассивации стекла покровные и предотвращения неспецифической адсорбции биомолекул и клеток. Далее, печать микроконтакта или падение пера литографии используется для создания треков стрептавидин на поверхности хроматированная в качестве точки крепления для биотинилированный пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) в качестве клея кия. Микрофлюидных устройство помещается на модифицированной поверхности и используется для создания градиента клей сигналы (100% РГД до 0% RGD) на стрептавидин треков. Наконец, те же микрофлюидных устройство используется для создания градиента хемоаттрактанта успешноч, как эмбриональная бычья сыворотка (FBS), так как растворимые кия в направлении, противоположном направлению градиента клей сигналы.
Introduction
Режиссер клеточной миграции является фундаментальным свойством многих клеток и является ключевым аспектом многих нормальных физиологических процессах, в том числе эмбрионального развития, защиты от инфекции и заживление ран. Кроме того, миграция клеток и играет важную роль во многих заболеваниях, таких как сосудистые заболевания, метастазирование опухолевых клеток и хронических воспалений 1,2. В то время как классические состояния клеточной миграции – поляризация, выступ расширение, формирование адгезия, сила поколения и задней отвода – как правило, принимается 3,4, выяснение пространственно-временные механизмы, с помощью которых сигнал интеграции координирует была более сложной.
Внеклеточного матрикса (ECM) служит субстратом для адгезии клеток, а через присущих химическим 5 и 6 физических разнообразие, предоставляет направленности сигналы для навигации 7,8. В дополнение к этим клеем сигналы 9, растворимые факторы 10-12 </ SUP>, таких как хемокинов и факторов роста, может вызвать направлены миграцию клеток через хемоаттрактанта рецепторов и их вниз по течению motogenic сигнализации. В настоящее время неизвестно, является ли участие и сигнализации через рецепторы адгезии (т.е. интегринов) или хемоаттрактанта рецепторов, таких как рецептор тирозинкиназы (RTK), являются доминирующими. Также не известно, является ли иерархия рецепторных систем являются специфическими типа клеток.
Онлайн микроскопии клетки дает огромное количество информации, которая не доступна в объеме анализов и могут быть объединены с микрофлюидных устройств для создания градиентов иммобилизованных 13,14 и растворимых сигналов 15 16. Метод, описанный здесь использует ряд простых и установил шаги для модификации поверхности в сочетании с коммерчески доступными микрофлюидных камеры для создания изображений анализа для миграции клеток, которые могут быть легко реализованы в лаборатории клеточной биологии (рис. 1). Собравшиесямикрофлюидных устройство имеет оптические свойства, сравнимые со стеклом 17 и градиенты диффузии молекул стабильны в течение по крайней мере 16 часов. Система может быть использована для эпифлуоресцентной и передовые методы микроскопии. В отличие от других установок хемотаксис 18, эта система подходит для записи медленно мигрируют, прилипшие клетки. Важно отметить, что система является модульной и легко позволяет внедрение альтернативных клея или растворимые сигналы миграции и исследования различных типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы использовали имеющийся в продаже микрофлюидных устройства (липкие-Slide Хемотаксис 3D от Ibidi) для изучения последствий химически модифицированной поверхности и хемоаттрактанта градиентов на миграцию клеток. Это микрофлюидных установка не требует потока, потом?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, финансирование из Австралийского исследовательского совета и национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, а также хотел бы поблагодарить Австралийский Национальный фонд для изготовления SU-8 мастер для микроконтакта печати. SHN при поддержке Министерства высшего образования Малайзии и Universiti Sains Малайзии.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
