Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.
Hücreler gibi ekstrasellüler matriks ve bu büyüme faktörleri gibi çözünür ipuçlarının glikoproteinleri gibi yapışkan ipuçlarının yüksek konsantrasyonlarda doğru algılayıp geçirebilirsiniz. Burada, canlı hücre görüntüleme ile uyumlu bir mikroakışkan haznesi, yapışkan ve çözünebilir ipuçlarının karşıt degradeler oluşturmak için bir yöntem özetlemektedir. Poli-L-lisin ve polietilen glikol (PEG-PLL) bir kopolimerin cam lameller etkisizleştirmek ve biyomoleküller ve hücre spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için kullanılır. Daha sonra, mikrokontak baskı ya da daldırma kalem litografi yapıştırıcı işaret olarak biyotinile peptid arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) için bağlantı noktaları olarak görev yapan pasif yüzeyler üzerinde streptavidin üzerinden parçaları oluşturmak için kullanılır. Bir mikroakışkan cihaz modifiye edilmiş yüzeye yerleştirilir ve streptavidin parça üzerinde yapışkan işaretler (100% 0 ile% RGD RGD) ve gradyan oluşturmak için kullanılır. Son olarak, aynı mikroakışkan cihaz bir kemoatraktan Suc bir gradyan oluşturmak için kullanılıryapışkan ipuçlarının gradyanı ters yönde çözünür işaret olarak fetal bovin serumu (FBS), gibi h.
Yönetmen hücre göçü birçok hücre temel bir özelliğidir ve embriyonik gelişim, enfeksiyona karşı savunma ve yara iyileşmesi gibi birçok normal fizyolojik süreçlerin, önemli bir yönüdür. Buna ek olarak, hücre göçü aynı zamanda damar hastalığı, tümör hücre metastazları ve kronik inflamasyon 1,2 gibi pek çok hastalıkta önemli bir rol oynar. Hücreleri klasik göç ülkeleri iken – polarizasyon, protrüzyon genişleme, adhezyon, kuvvet oluşturma ve arka retraksiyon oluşumu – genellikle 3,4 kabul edilir, sinyal entegrasyon koordine edildiği zamanmekansal mekanizmalarının aydınlatılmasında daha zor olmuştur.
Ekstrasellüler matriks (ECM) hücre yapışması için bir substrat olarak hizmet verir ve doğal kimyasal ve fiziksel 5 6 çeşitliliği ile, cep navigasyon 7,8 için directional kuyruklarını sağlar. Bu yapışkan işaretler 9, çözünür faktörlerin 10-12 ek olarak </ Sup> gibi kemokin ve büyüme faktörleri gibi olabilir kemoatraktan reseptörleri ve onların aşağı motogenic sinyalizasyon yönlendiriliyor hücre göçü teşvik. Şu anda, nişan ve adezyon reseptörleri (yani integrinler) ya da reseptör tirozin kinaz (RTK) olarak kemoatraktan reseptörleri yoluyla sinyal, baskın olup olmadığı bilinmemektedir. Ne de reseptör sistemlerinin hiyerarşileri hücre tipine özgül olduğunu bilinmektedir.
Canlı hücresi mikroskopi toplu tayinlerde erişilebilir değildir ve immobilize 13,14 ve çözünür ipuçları 15 16 degradeleri oluşturmak için mikroakışkan cihazlar ile kombine edilebilir bir bilgi zenginliği verir. Burada açıklanan yöntem kolayca bir hücre biyolojisi laboratuvar (Şekil 1) de uygulanabilir olması hücre göçü için bir görüntüleme tahlil oluşturmak için ticari olarak mevcut microfluidic bölme ile bağlantılı olarak yüzey modifikasyonu için basit ve köklü bir dizi adım kullanır. MonteMikroakışkan cihaz cam 17 ile karşılaştırılabilir ve dağılabilir molekül gradyanlar en az 16 saat boyunca stabil optik nitelikleri vardır. Sistem Epifloresans ve ileri mikroskopi için teknikler de kullanılabilir. Diğer kemotaksisi düzeneklerinin 18 farklı olarak, bu sistem yavaş yavaş göç eden, yapışık hücre kayıt için uygundur. Önemlisi, sistemin modüler ve kolaylıkla alternatif yapıştırıcı veya çözünebilir göç ipuçları ve çeşitli hücre tiplerinin incelenmesi giriş sağlar.
Bu protokol, hücre göçü üzerine kimyasal olarak modifiye yüzeyler ve kemoatraktan degradelerin etkilerini incelemek için (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D) piyasada satılan bir mikroakışkan cihaz kullanılır. Gradyan kanalın uzunluğu boyunca difüzyon ile kurulmuş olmasıdır mikroakış ayar akış gerektirmez. Akış ayirt kararlı gibi fokal adezyon ve küçük odak kompleksleri ve sinapsların 26 oluşturacak en lökositler gibi hızlı göç hücreleri oluşturmak fibro…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Avustralya Araştırma Konseyi ve Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi fon kabul ve teşekkür Mikrokontak baskı için SU-8 master için Avustralya Ulusal İmalat Tesisi. SHN Yükseköğretim Malezya ve Universiti Sains Malezya Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
Oven | Binder | ED 53 series | |
Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
Vaseline | Sigma | 16415 | |
Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |