Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark
Summary
Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.
Abstract
Intraparenchymalen Injektion eines viralen Vektors ermöglicht bedingten Genmanipulation in unterschiedliche Populationen von Neuronen oder bestimmte Bereiche des zentralen Nervensystems. Wir demonstrieren eine stereotaktische Injektion Technik, gezielt Genexpression oder Silencing im dorsalen Horn des Rückenmarks Maus ermöglicht. Der chirurgische Eingriff ist kurz. Es erfordert Laminektomie eines einzelnen Wirbel, bietet für eine schnelle Wiederherstellung des Tieres und ungestörte Beweglichkeit der Wirbelsäule. Kontrollierte Injektion eines kleinen Vektor Suspensionsvolumen bei niedriger Drehzahl und die Verwendung eines Mikrospritze mit abgeschrägten Glaskanüle minimieren Gewebeläsion. Die lokale Immunantwort auf den Vektor, hängt von den spezifischen Eigenschaften des Virus eingesetzt; in unserer Erfahrung ist es kleinen und kurzlebigen wenn ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus verwendet wird. Ein Reportergen wie verstärkt grün fluoreszierende Protein erleichtert die Beobachtung räumliche Verteilung des Vektors oder der Wirksamkeit und zellulären Spezificity der Transfektion.
Introduction
Fortgeschrittenen Technologien bedingter Genmanipulation in der Maus zu ermöglichen vielfältige Ansätze zur Exploration von synaptischen Bahnen und funktionelle Verbindungen im zentralen Nervensystem. Transgene können durch niedermolekulare Effektoren wie Doxycyclin Einwirken auf ein Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator, die für den Einsatz als Repressor oder Aktivator der Gentranskription, oder Tamoxifen Erkennen eines mutierten Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors 1 funktionieren kann geregelt werden . Irreversible Modifikation Transgen wird üblicherweise von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Rekombinasen erreicht. Cre (Ursachen Rekombination) und Flp (Flippase Rekombinationsenzyms) katalysieren die Exzision, Inversion oder Translokation von DNA-Fragmenten, die von loxP (locus der Kreuzung x über, P1) oder Frt (Flippase Anerkennung target) Seiten bzw. 1 flankiert werden. Zu den Anwendungen gehören Gen-Aktivierung oder Inaktivierung und induzierbare Ribonukleinsäure (RNA) Störungen <sup> 2. Bedingungsausdruck von fluoreszierenden oder enzymatischen Reporter wie β-Galactosidase oder alkalischer Phosphatase verwendet werden, um Neuronen beschriften und prüft ihre topische Organisation und Konnektivität 3 werden. Large-scale Mutagenese-Projekte in Nordamerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) und Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produzieren Bibliotheken embryonalen Stammzellen der Maus Zellklone mit bedingten Gen-Targets und Fallen, die letztlich auf das gesamte Maus-Genom. Mäuse aus diesen Klonen erzeugt werden, können mit einer wachsenden Zahl von Maus Linien gekreuzt werden, daß DNA-Rekombinasen exprimieren unter Promotoren oder Loci für eine bestimmte Population von Neuronen zur selektiven Genmanipulation ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Allerdings kann die Beschränkung auf Genmanipulation unterschiedliche Populationen von Neuronen oder bestimmten Regionen von Interesse nicht durch genetische Targeting allein, wenn ein Promotor spezifisch für die Neuronenpopulation von Interesse nicht bekannt ist und nicht von allen Neuronen in der Region exprimiert erreicht werden von Interesse. Im Rückenmark können experimentellen Designs erfordern räumlichen Beschränkung der Genmanipulation ein oder zwei kraniokaudalen Segmente. Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, Cre oder Flp drückt ermöglicht Begrenzen Genrekombination in Regionen im Rückenmark von Mäusen, in denen DNA-Fragmente von loxP-oder FRT-Stellen flankiert sind, so genannte floxed oder flrted Allelen. Anders als konstitutive DNA-Umlagerung, die würde aus Kreuzungen der Tiere mit Rekombinase exprimierenden Mäusen führen, diese Strategie auch zeitliche Kontrolle über Gen-Aktivierung oder Inaktivierung. Virale Vektoren kodieren gefloxten oder geflirtet Transgene bieten eine umgekehrte Möglichkeit Genmanipulation in Mäusen, die corresponding Rekombinase stromabwärts eines Neuron-spezifischen Promotors. Mehrere rekombinante Vektoren mit Affinität zu Neuronen sind 4. Hochleistungs-(gutless) Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes simplex-Virus und Lentivirus-Vektoren werden üblicherweise neurotropen verwendet. Die Auswahl des geeigneten Virus für eine Fragestellung ist ein wichtiger Teil des experimentellen Designs. Größe des Transgens, Lieferroute, Spezifität der Infektion mit Neuronen, um Gliazellen, Infektion Wirksamkeit, entzündlichen und toxische Nebenwirkungen müssen berücksichtigt werden 4 entgegengesetzt.Hier beschreiben wir die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors in der dorsalen Horn des Rückenmarks, eine Technik, die wir verwenden zur bedingten Genregulation in unserer Forschung über die Neurobiologie von Schmerz. Das Hinterhorn erhält afferenten Input von primären somatosensorischen Neuronen einschließlich nozizeptiven Neuronen. Lokale Interneurone verarbeiten die Informationen vor der Projektion Neuronen vermitteln sie ausdas Hinterhorn des Gehirns 5. Wir demonstrieren die Infektion von Dorsalhorn spinalen Neuronen an Segmentebene L4 mit einem neurotropen rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), das verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) drückt unter einem konstitutiv aktiven CMV-Promotors.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaktische Injektion ermöglicht Targeting-Vektor Rückenmarksneuronen für Anwendungen wie neuronale Netzwerk-Mapping basierend auf transsynaptische Virusverschleppung 6,7 oder optogenetische Dissektion 8, Axon Führung während der Regenerierung vor Verletzungen 9,10 oder Gentherapie zur Prävention oder Behandlung von Neurodegeneration 11, 12. Virale Vektoren sind für Genmanipulation worden im Rückenmark verwendet, um zu untersuchen somatosensorischen, Motor und vege…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direktor des Vector Entwicklung und Produktion in der Neuroscience Center of Massachusetts General Hospital in Charlestown, Massachusetts, für die Bereitstellung der rAAV-EGFP Vektor, und John Whang für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von grant R01 NS050408 (JS) aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke unterstützt.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
