立体定向注射病毒载体的基因操作在小鼠脊髓条件
Summary
病毒载体可以进行有针对性的基因操作。我们提出了一个条件性基因的表达或消融方法在小鼠脊髓，采用立体的病毒载体注射到脊髓背角，初级躯体感觉传入中枢神经系统的神经元之间的突触接触的一个突出的部位。
Abstract
实质内注射病毒载体使在不同人群的中枢神经系统的神经元或特定区域的条件的基因操作。我们展示了一个立体的注射技术，可以使靶基因的表达或沉默的小鼠脊髓背角。手术是短暂的。它需要一个单一的椎椎板切除术，提供快速恢复脊柱的动物和不受影响的活力。在低速和使用微量的斜角玻璃套管控喷射的小矢量悬浮液体积减少组织损伤。局部免疫反应的矢量取决于采用的病毒的内在特性;根据我们的经验，这是轻微和短暂的，使用时的重组腺相关病毒。如增强型绿色荧光蛋白报告基因的方便的载体，空间分布监测和疗效和蜂窝指定的转染ficity。
Introduction
有条件的基因操作在小鼠的先进技术，使多方面的探索中枢神经系统的的突触途径和功能连接方法。转基因可能是受小分子效应如强力霉素，四环素控制的反式激活，它可以被设计为充当一个阻遏或激活基因转录，或他莫昔芬承认的雌激素受体1的配体结合域的突变作用于。通常是不可逆的转基因修饰的实现由脱氧核糖核酸（DNA）的重组酶。华创（的原因重组）和FLP（flippase重组酶）催化loxP位（轨迹，穿越x，P1）或首次登记税（flippase识别目标）的网站，分别为1的DNA片段，这些片段两侧切除，反转或易位。应用范围包括基因的激活或沉默和诱导型核糖核酸（RNA）干扰<sup> 2。可以使用的条件表达的荧光或酶如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶的记者标记神经元，并检查它们的局部组织和连接3。大型诱变项目在北美（ http://www.norcomm.org/index.htm ）和欧洲（ http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ）的小鼠胚胎干细胞克隆库有条件的靶基因和陷阱，最终将覆盖整个小鼠基因组中。鼠标线膨胀的数目，反映根据特定的神经元的选择性基因操作（ http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index某一特定人群的启动子或基因座的DNA的重组酶，可以划线，从这些克隆产生的小鼠PHP ）。
<p class="“jove_content”">然而，限制基因操作不同人群的神经元或感兴趣的特定区域可能不实现通过基因单独定位，如果还没有已知的或不表达在该区域的所有神经元到神经元特异性的启动子人口的利益的兴趣。在脊髓中，实验设计，可能需要一个或两个头尾段空间限制的基因操作。立体定位注射病毒载体表达Cre或FLP，允许限制基因重组小鼠脊髓中的DNA片段由loxP位或frt位点两侧的区域，即所谓的两侧装接loxP的或flrted等位基因。与组成DNA重排，这将导致从杂交育种与重组表达小鼠的动物，这种策略还提供了时间控制基因的激活或沉默。病毒载体编码两侧装接loxP或调情转基因提供了一个逆向选择的基因操作在小鼠体内表达的corresponding重组的神经元特异性启动子的下游。重组表达载体亲和力的神经元是4。高容量（无胆）腺病毒，腺相关病毒，单纯疱疹病毒和慢病毒常用嗜神经载体。选择合适的病毒用于研究的问题是实验设计的一个重要组成部分。的转基因的大小，送货路线，特异性感染的神经元，而不是神经胶质细胞，感染的疗效，炎性和毒性副作用需要考虑4。在这里，我们描述了立体的病毒载体注射到脊髓背角，采用的技术，我们的条件在我们的研究对疼痛的神经生物学基因调控。背角接收传入的初级躯体感觉神经元的输入，包括伤害性神经元。当地的interneurons处理信息，然后投射神经元的传递从背角的大脑5。我们展示了一种嗜神经的重组腺相关病毒（rAAV），组成性激活的巨细胞病毒启动子表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）下背角神经元在脊髓节段L4感染。
Protocol
Representative Results
Discussion
立体定向的载体注射可针对脊髓神经元的应用程序，如神经网络映射的基础上跨突触传播的病毒6,7或optogenetic解剖，轴突引导再生过程中从伤病中9,10，或基因治疗用于预防或治疗神经退行性疾病11， 12。病毒载体用于基因操作的脊髓研究躯体感觉，运动和植物神经途径9,10,13-15。鼠标是最广泛使用的模式生物的研究涉及立体病毒载体注射到大脑或脊髓，但该技术已?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Bakhos A. Tannous，博士为我们提供的rAAV-EGFP载体，载体的开发和生产在马萨诸塞州的查尔斯顿，马萨诸塞州总医院，神经科学中心的主任，约翰·王海提供技术援助。这项工作是支持的补助R01 NS050408（JS）由美国国家神经疾病与中风研究所。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
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