הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס
Summary
וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.
Abstract
הזרקת Intraparenchymal של וקטור ויראלי מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית באוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית. אנחנו מדגימים את טכניקת הזרקת stereotaxic המאפשרת ביטוי ממוקד גן או השתקה בקרן האחורית של חוט שדרת העכבר. הליך הכירורגים קצר. זה דורש laminectomy של חוליה אחת, לספק להתאוששות מהירה של בעל החיים שאינם פגומה ותנועתיות של עמוד השדרה. הזרקה מבוקרת של נפח השעית וקטור קטן במהירות ושימוש נמוך של microsyringe עם צינורית זכוכית משופעת למזער את הפגיעה ברקמות. התגובה החיסונית המקומית לווקטור תלוי במאפיינים הפנימיים של הווירוס מועסק; בניסיון שלנו, זה קל וקצר ימים, כאשר וירוס אדנו הקשורים בשימוש. גן כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאפשר פיזור המרחבי ניטור של הווקטור, ואת היעילות והסלולרי specificity של transfection.
Introduction
טכנולוגיות מתקדמות של מניפולציה גנטית מותנית בעכבר מאפשרות גישות רבות פנים לחקר מסלולים וקשרים סינפטיים תפקודיים במערכת העצבים המרכזית. Transgenes עשוי להיות מוסדר על ידי effectors מולקולה קטנה כגון דוקסיציקלין פועלת על transactivator טטרציקלין מבוקר, אשר יכול להיות מתוכנן לתפקד כמדכא או activator של שעתוק גנים, או טמוקסיפן הכרת תחום מוטצית יגנד מחייב של קולטן אסטרוגן 1 . שינוי בלתי הפיך transgene מושגת בדרך כלל על ידי חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) recombinases. Cre (רקומבינציה סיבות) וFLP (אנזים רקומבינציה flippase) לזרז את הכריתה, היפוך או טרנסלוקציה של מקטעי דנ"א המוקפים loxP (לוקוס של x המעבר מעל, P1) או FRT (יעד ההכרה flippase) אתרים בהתאמה 1. יישומים כוללים הפעלת גן או השתקה וחומצה ריבונוקלאית מושרה (RNA) הפרעות <sup > 2. ביטוי תנאי כתבי ניאון או האנזימטית כגון β-גלקטוזידאז או phosphatase אלקליין ניתן להשתמש כדי לתייג תאי עצב ולבדוק את הארגון וקישוריות 3 האקטואליים שלהם. פרויקטי mutagenesis רחב היקף בצפון אמריקה (http://www.norcomm.org/index.htm) ובאירופה (http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm) מייצרים ספריות של שיבוטי תאי גזע עובריים של עכברים עם יעדים מותנים גנים ומלכודות שסופו של דבר מכסים את כל גנום העכבר. עכברים שנוצרו משיבוטים אלה עשויים להיות חצו עם מספר ההולך וגדל של קווי עכברים שמבטאים recombinases DNA תחת יזמים או לוקוסים ספציפיים לאוכלוסייה מסוימת של תאי עצב למניפולציה גנטית סלקטיבי (http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . Php).
<p class= "Jove_content"> עם זאת, הגבלת מניפולציה גנטית לאוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של עניין לא יכולה להיות מושגת על ידי מיקוד גנטי לבד אם אמרגן ספציפי לאוכלוסיית הנוירון של ריבית אינו ידוע או שאינו באו לידי ביטוי בכל תאי העצב באזור של עניין. בחוט השדרה, עיצובים ניסיוניים עשויים לדרוש הגבלה המרחבי של המניפולציה הגנטית לקטע אחד או שתיים craniocaudal. הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי שמבטא Cre או FLP מאפשר הגבלת רקומבינציה גן לאזורים בחוט השדרה של עכברים שבברי DNA הם מוקפים אתרי FRT loxP או, מה שמכונה אללים floxed או flrted. בניגוד לארגון מחדש דנ"א מכונן, אשר יגרום מהכלאת החיות עם עכברים המבטאים recombinase, אסטרטגיה זו גם מספקת שליטה זמנית על הפעלת גן או השתקה. וקטורים ויראליים קידוד floxed או פלירטט transgenes להציע אופציה הפוכה של מניפולציה גנטית בעכברים המבטאות את corresponding מורד recombinase של אמרגן נוירון ספציפי. כמה וקטורים רקומביננטי עם זיקה לנוירונים זמינים 4. קיבולת גבוהה אדנווירוס (פחדן), וירוס adeno-משויך, וירוס הרפס סימפלקס וlentivirus משמשים וקטורי neurotropic. בחירת הווירוס המתאים לשאלת מחקר היא חלק מכריע בעיצוב ניסיוני. גודל transgene, מסלול משלוח, סגולי של הזיהום לנוירונים בניגוד לתאי גליה, יעילות זיהום, תופעות לוואי רעילות דלקתיות וצריכות להילקח בחשבון 4.כאן אנו מתארים את זריקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית של חוט השדרה, טכניקה שאנו נוקטים לויסות גנים מותנות במחקר שלנו על נוירוביולוגיה של כאב. הקרן הגבתה מקבלת קלט מביא מהנוירונים חושיים עיקריים כוללים נוירונים nociceptive. interneurons המקומי לעבד את המידע לפני נוירונים הקרנה להעביר אותו מקרן האחורית למוח 5. אנחנו מדגימים את הזיהום של נוירונים קרן אחורית ברמה מגזרית שדרת L4 עם וירוס neurotropic אדנו-משויך (rAAV) שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGfp) תחת אמרגן ציטומגלווירוס constitutively פעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרקת הווקטור Stereotaxic מאפשרת מיקוד תאי עצב בחוט שדרה עבור יישומים כגון מיפוי רשת עצבית המבוסס על הנגיף מתפשט transsynaptic 6,7 או נתיחת optogenetic 8, הדרכת האקסון במהלך רגנרציה מפציעת 9,10, או טיפול גנטי למניעה או הטיפול של 11 ניוון מוחיה, 12. וקטורים נגיפי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Bakhos א טנוס, Ph.D., מנהל פיתוח וקטור וההפקה במרכז למדעי מוח בית החולים כלליים מסצ'וסטס, Charlestown, מסצ'וסטס, שספק לנו את וקטור rAAV-eGfp, וג'ון בנג לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 NS050408 (לי.ס.) מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
