Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши
Summary
Вирусные векторы позволяют целевой манипуляции генов. Мы демонстрируем метод условное выражение гена или абляции в спинном мозге мышей, с использованием стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге, известный сайт синаптических контактов между первичной соматосенсорной афферентов и нейронов центральной нервной системы.
Abstract
Интрапаренхимальные инъекции вирусного вектора позволяет условные манипуляции генов в различных популяциях нейронов или отдельных регионов центральной нервной системы. Мы демонстрируем стереотаксической техники инъекции, которые позволяют целевых экспрессии гена или глушителей в дорсальных рогов спинного мозга мыши. Хирургическая процедура является кратким. Это требует ламинэктомия одного позвонка, обеспечивая быстрое восстановление животного и беспрепятственный подвижность позвоночника. Контролируемое введение небольшого объема подвески вектора на низкой скорости и использованию микрошприца со скошенными канюли стекла свести к минимуму ткани поражения. Местный иммунный ответ на вектора зависит от внутренних свойств вируса занятых; по нашему опыту, это незначительный и недолговечным, когда рекомбинантный адено-связанный вирус используется. Ген-репортер, такие как усовершенствованные зеленого флуоресцентного белка облегчает контроль пространственное распределение вектора, а также эффективность и клеточных образцахficity трансфекции.
Introduction
Передовые технологии условного манипуляции генов у мышей позволяют многогранного подхода к изучению синаптических путей и функциональных связей в центральной нервной системе. Трансгенов может регулироваться малые молекулы эффекторы, такие как доксициклин, действующих на тетрациклин-контролируемой трансактиватор, которые могут быть разработаны, чтобы функционировать как репрессор или активатор транскрипции генов, или тамоксифен признании мутировал лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена 1 . Необратимое изменение трансгенов обычно достигается путем дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) рекомбиназ. Cre (причины рекомбинации) и ФЛП (flippase рекомбинации фермент) катализирует вырезание, инверсии или транслокации фрагментов ДНК, которые в окружении loxP (локус пересечения х более, P1) или Frt (flippase распознавания целей) сайтов, соответственно 1. Приложения включают активацию гена или глушителей и индуцируемой рибонуклеиновой кислоты (РНК) помех <sup> 2. Условное выражение флуоресцентной или ферментативных журналисты, такие как β-галактозидазы или щелочной фосфатазы может быть использован для обозначения нейронов и изучить их актуальность организации и подключение 3. Крупномасштабные проекты мутагенеза в Северной Америке ( http://www.norcomm.org/index.htm ) и Европы ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) производит библиотеки мышиных эмбриональных клонов стволовых клеток, с условные цели генов и ловушки, которые в конечном итоге охватить весь геном мыши. Мыши, полученные от этих клонов могут быть скрещены с расширением количества линий мышей, которые выражают ДНК рекомбиназ под промоутеров или локусы для конкретной популяции нейронов для селективной манипуляции генов ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP ).
<p class= "Jove_content"> Тем не менее, ограничение генной манипуляции на отдельных популяций нейронов или отдельных регионов представляет интерес не может быть достигнуто путем генетического таргетинга в покое, если промоутер, специфичные для нейронов населения проценты не известны или не выражается всех нейронов в регионе интерес. В спинном мозге экспериментальных конструкций может потребоваться пространственное ограничение генной манипуляции с одним или двумя краниокаудальном сегментов. Стереотаксическая инъекции вирусного вектора, который выражает Cre или Flp позволяет ограничить рекомбинации генов в регионах в спинном мозге мышей, в которых фрагменты ДНК в окружении loxP или Frt сайтов, так называемые floxed или flrted аллелей. В отличие от учредительного перестройка ДНК, который бы в результате скрещивания животных с рекомбиназой выражения мышей, эта стратегия также предусматривает временную контроль за активацию гена или глушителей. Вирусные векторы, кодирующие floxed или флиртовал трансгенов предлагают обратный вариант гена манипуляций у мышей, экспрессирующих correspoрекомбиназой нахождении на выходе из специфичные для нейронов промотора. Несколько рекомбинантных векторов с близостью к нейроны имеются 4. Высокая емкость (слабый), аденовирусы, адено-связанный вирус, вирус простого герпеса и лентивирус обычно используются нейротропных векторов. Выбор соответствующего вируса для исследования вопроса является важной частью эксперимента. Размер трансгена, маршрут доставки, специфика инфекции в нейронах, в отличие от глиальных клеток, инфекция эффективность, воспалительных и токсических побочных эффектов необходимо учитывать 4.Здесь мы описываем стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге спинного мозга, метод, который мы используем для условного регуляции генов в наших исследованиях по нейробиологии боли. Заднего рога получает афферентного входа от первичной соматосенсорной нейронов в том числе ноцицептивных нейронов. Местные интернейроны обрабатывать информацию, прежде чем проекция нейроны передают его иззаднем роге в мозг 5. Мы демонстрируем инфекции нейронов заднего рога спинного сегментарных на уровне L4 с нейротропных рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAV), который выражает усиливается зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под постоянно активной цитомегаловирусной промоутер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стереотаксическая инъекции вектора ориентации позволяет нейронов спинного мозга для приложений, таких как нейронные отображения сети на основе транссинаптических распространения вирусов или 6,7 optogenetic рассечение 8, аксон руководства во время регенерации после травмы 9,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Bakhos А. Tannous, доктор философии, директор по развитию векторного и производства в неврологии Центра Massachusetts General Hospital, Charlestown, штат Массачусетс, за предоставление нам rAAV-EGFP вектор, и Джон Whang для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана грантом R01 NS050408 (на JS) из Национального института неврологических расстройств и инсульта.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
