Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón
Summary
Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.
Abstract
Inyección intraparenquimatosa de un vector viral permite la manipulación génica condicional en distintas poblaciones de neuronas o regiones particulares del sistema nervioso central. Se demuestra una técnica de inyección estereotáxica que permite la expresión del gen objetivo o el silenciamiento en el cuerno dorsal de la médula espinal de ratón. El procedimiento quirúrgico es breve. Se requiere laminectomía de una sola vértebra, proporcionando para la recuperación rápida del animal y de la motilidad irreprochable de la columna vertebral. Inyección controlada de un volumen pequeño vector suspensión a baja velocidad y el uso de una microjeringa con cánula de cristal biselado minimizar la lesión del tejido. La respuesta inmune local al vector depende de las propiedades intrínsecas del virus empleados, en nuestra experiencia, es menor y de corta duración cuando un recombinante de virus adeno-asociado se utiliza. Un gen informador tal como la proteína verde fluorescente mejorada facilita la distribución de seguimiento espacial del vector, y la eficacia y la especificidad celularficidad de la transfección.
Introduction
Las tecnologías avanzadas de manipulación de genes en el ratón condicional permitir que los enfoques multifacéticos para la exploración de las vías sinápticas y las conexiones funcionales en el sistema nervioso central. Los transgenes pueden ser reguladas por efectores de moléculas pequeñas tales como doxiciclina que actúan sobre un transactivador controlado por tetraciclina, que puede ser diseñado para funcionar como un represor o un activador de la transcripción de genes, o tamoxifeno reconociendo un ligando mutado dominio de unión del receptor de estrógeno 1 . Modificación irreversible transgén se consigue comúnmente por el ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinasas. Cre (recombinación causas) y FLP (enzima flipasa recombinación) catalizan la escisión, la inversión o translocación de fragmentos de ADN que están flanqueadas por loxP (locus de cruce sobre x, P1) o frontales (objetivo flipasa reconocimiento) los sitios, respectivamente 1. Las aplicaciones incluyen la activación de genes o el silenciamiento y inducible por ácido ribonucleico (ARN) interferencia <sup> 2. Expresión condicional de reporteros fluorescentes o enzimáticos, tales como β-galactosidasa o fosfatasa alcalina se puede utilizar para etiquetar las neuronas y examinar su organización tópica y conectividad 3. Proyectos a gran escala de mutagénesis en América del Norte ( http://www.norcomm.org/index.htm ) y Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) están produciendo bibliotecas de clones de embriones de ratón con células madre objetivos condicionales de genes y trampas que eventualmente se cubren todo el genoma del ratón. Los ratones generados a partir de estos clones se pueden cruzar con un número creciente de líneas de ratón que expresan recombinasas de ADN bajo promotores o loci específicos para una población particular de neuronas para la manipulación selectiva de genes ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Sin embargo, la restricción de manipulación génica para diferentes poblaciones de neuronas o regiones particulares de interés no puede lograrse mediante modificación genética dirigida solo si un promotor específico para la población de neuronas de interés no se conoce o no se expresan por todas las neuronas en la región de interés. En la médula espinal, los diseños experimentales pueden requerir restricción espacial de la manipulación genética de uno o dos segmentos craneocaudal. Inyección estereotáxica de un vector viral que expresa Cre o Flp permite limitar la recombinación de genes para las regiones en la médula espinal de ratones en los que los fragmentos de ADN están flanqueados por sitios FRT o loxP, los llamados alelos floxed o flrted. A diferencia de la reordenación del ADN constitutiva, que sería el resultado de cruzamiento de los animales con ratones que expresan recombinasa, esta estrategia también proporciona un control temporal sobre la activación de genes o el silenciamiento. Los vectores virales que codifican floxed o coqueteó transgenes ofrecen una opción inversa de la manipulación genética en ratones que expresan el corresponding aguas abajo de un promotor de recombinasa específica de neuronas. Varios vectores recombinantes con afinidad a las neuronas están disponibles 4. De alta capacidad (gutless) adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple y lentivirus son comúnmente utilizados vectores neurotrópicos. Selección del virus apropiado para una pregunta de investigación es una parte crucial del diseño experimental. Tamaño del transgén, vía de administración, la especificidad de la infección a las neuronas frente a las células gliales, infección de eficacia, los efectos secundarios inflamatorios y tóxicos necesitan ser considerados 4.Aquí se describe la inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal de la médula espinal, una técnica que se emplea para la regulación génica condicional en nuestra investigación sobre la neurobiología del dolor. El cuerno dorsal recibe impulsos aferentes primarios de neuronas somatosensoriales incluyendo las neuronas nociceptivas. Interneuronas locales procesar la información antes de transmitirla neuronas de proyección deel cuerno dorsal al cerebro 5. Se demuestra que la infección de las neuronas del asta dorsal a nivel espinal segmentaria L4 con un neurotrópico recombinante adeno-associated virus (rAAV) que expresa aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo un promotor de citomegalovirus constitutivamente activo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inyección del vector estereotáxica permite dirigir las neuronas de médula espinal para aplicaciones tales como mapeo de la red neuronal basada en virus transsynaptic propagación 6,7 o disección optogenético 8, guiado de los axones durante la regeneración de lesiones 9,10, o la terapia génica para la prevención o el tratamiento de la neurodegeneración 11, 12. Los vectores virales han sido utilizados para la manipulación de genes en la médula espinal para estudiar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a A. Bakhos Tannous, Ph.D., Director de Desarrollo y Producción del vector en el Centro de Neurociencia del Hospital General de Massachusetts en Charlestown, Massachusetts, para que nos proporciona el vector rAAV-EGFP, Whang y Juan de asistencia técnica. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01 NS050408 (a JS) del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
