Stereotaktisk injektion av en viral vektor för villkorad Gene Manipulation i ryggmärgen hos möss
Summary
Virala vektorer möjliggöra målinriktat genmanipulation. Vi visar ett förfarande för villkorlig genexpression eller ablation i mus ryggmärgen, med stereotaktisk injektion av en viral vektor i den dorsala hornet, en framstående plats av synaptisk kontakt mellan primära somatosensoriska afferenter och neuroner i det centrala nervsystemet.
Abstract
Intraparenkymal injektion av en viral vektor möjliggör villkorlig genmanipulation i distinkta populationer av nervceller eller vissa regioner i centrala nervsystemet. Vi visar en stereotaxisk injektion teknik som tillåter riktad genexpression eller tystande i det dorsala hornet av ryggmärgen hos möss. Det kirurgiska ingreppet är kort. Det kräver laminektomi av en enda kota, ger för snabb återhämtning av djuret och felfri motilitet av ryggraden. Kontrollerad injektion av en liten vektor upphängning volym på låg hastighet och användning av en mikrospruta med avfasade glas kanyl minimera vävnaden lesionen. Den lokala immunsvaret till vektorn beror på de inneboende egenskaperna hos den använda viruset, i vår erfarenhet, är det mindre och kortlivat när en rekombinant adeno-associerat virus används. En reportergen som förstärkt grönt fluorescerande protein underlättar övervakning rumsliga fördelningen av vektorn, och effekt och cellulära speficity av transfektionen.
Introduction
Avancerad teknik för villkorad genmanipulation i musen möjliggör mångsidiga tillvägagångssätt för utforskandet av synaptiska vägar och funktionella anslutningar i det centrala nervsystemet. Transgener kan regleras genom små molekyler effektorer såsom doxycyklin verkar på en tetracyklin-kontrollerad transaktivator, som kan vara utformad för att fungera som en repressor eller en aktivator av gentranskription, eller tamoxifen som känner igen en muterad ligandbindande domänen av östrogenreceptorn en . Irreversibel transgen modifiering uppnås vanligen genom deoxiribonukleinsyra (DNA) rekombinaser. Cre (orsakar rekombination) och Flp (flippas rekombination enzym) katalyserar excision, inversion eller flyttning av DNA-fragment som flankeras av loxP (platsen för korsning X över, P1) eller Främre (flippas erkännande mål) platser, respektive 1. Applikationer inkluderar genaktivering eller tysta och inducerbara ribonukleinsyra (RNA) interferens <sup> 2. Villkorlig uttryck av fluorescerande eller enzymatiska reportrar såsom β-galaktosidas eller alkaliskt fosfatas kan användas för att märka neuroner och undersöka deras aktuella organisation och anslutningsmöjligheter 3. Storskaliga mutagenes projekt i Nordamerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) och Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) producerar bibliotek av mus embryonala kloner stamceller med villkorade gen mål och fällor som så småningom kommer att täcka hela musens arvsmassa. Möss som genereras från dessa kloner kan korsas med en växande antal av mus linjer som uttrycker DNA rekombinaser enligt promotorer eller loci som är specifika för en viss population av nervceller för selektiv genmanipulation ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> får dock begränsa genmanipulation till olika populationer av nervceller eller särskilda områden av intresse inte uppnås genom genetisk inriktning ensam om en promotor som är specifik för neuron befolkningen av intresse inte är känd eller inte uttrycks av alla neuroner i regionen av intresse. I ryggmärgen, kan experimentell design kräver rumslig begränsning av genmanipulation till en eller två craniocaudal segment. Stereotaktisk injektion av en viral vektor som uttrycker Cre eller Flp kan begränsa genrekombination till regioner i ryggmärgen hos möss som DNA-fragment flankeras av loxP eller FRT-ställen, så kallade floxed eller flrted alleler. Till skillnad från konstitutivt DNA ombildning, vilket skulle leda till korsbefruktning djuren med rekombinas uttrycker möss, ger denna strategi också temporal kontroll över genaktivering eller tystande. Virala vektorer som kodar floxade eller flirtade transgener erbjuder en omvänd möjlighet genmanipulation i möss som uttrycker corresponding rekombinas nedströms en neuron-specifik promotor. Flera rekombinanta vektorer med affinitet till nervceller är tillgängliga 4. Hög kapacitet (feg) adenovirus, adenoassocierat virus, herpes simplex-virus och lentivirus-används vanligen neurotropa vektorer. Välja lämplig viruset för en forskningsfråga är en viktig del av den experimentella designen. Storlek av transgenen, leverans väg, specificitet av infektionen till neuroner i motsats till gliaceller, infektion effektivitet, inflammatoriska och toxiska bieffekter måste beaktas 4.Här beskriver vi stereotaxisk injektion av en viral vektor in dorsalhorn av ryggmärgen, en teknik som vi använder för villkorlig genreglering i vår forskning om neurobiologi av smärta. Den dorsala hornet får afferenta input från primära somatosensoriska neuroner, inklusive nociceptiva neuroner. Lokala interneuronen bearbeta informationen innan projektionen nervceller förmedlar den fråndorsalhorn till hjärnan 5. Vi visar att infektion av dorsala horn neuroner på spinal segmentell nivå L4 med en neurotrop rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) som uttrycker förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under en konstitutivt aktiv cytomegalovirus-promotorn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaktisk vektor injektion tillåter inriktning ryggmärgen nervceller för applikationer såsom neuronala nätverk kartläggning baserad på transsynaptisk virus sprids 6,7 eller optogenetic dissektion 8, axon vägledning under regenerering från skada 9,10 eller genterapi för förebyggande eller behandling av neurodegenerering 11, 12. Virala vektorer har använts för genmanipulation i ryggmärgen för att studera somatosensoriska, motor och autonoma vägar 9,10,13…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bakhos A. Tannous, Ph.D., chef för vektor Utveckling och produktion i Centrum för neurovetenskap i Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, för att ge oss med rAAV-EGFP vektor, och John Whang för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av bidrag R01 NS050408 (till JS) från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
