Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial
Summary
A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento livremente<em> In vivo</em> Pulmão do rato.
Abstract
O glycocalyx é uma camada endotelial de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem o lúmen vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL), que contribui para a manutenção da função endotelial. À medida que o glicocálice endotelial é muitas vezes aberrante in vitro e é perdida durante as técnicas de fixação de tecidos normais, o estudo do ESL requer o uso de microscopia intravital. Para melhor a fisiologia do complexo aproximado da microvasculatura alveolar, imagens intravital pulmonar está idealmente realizada em um pulmão livremente movimento. Estas preparações, no entanto, geralmente sofrem de artefacto de movimento extensivo. Demonstramos como de tórax fechado de microscopia intravital de um pulmão de rato livremente móvel pode ser usado para medir a integridade glicocálice via ESL exclusão de fluorescentemente marcadas com dextranos de elevado peso molecular a partir da superfície endotelial. Esta técnica não-recuperação cirúrgica, que requerbrightfield simultânea e de imagem de fluorescência do pulmão do rato, permite a observação longitudinal da microvasculatura subpleural sem evidência de induzir lesão pulmonar confusão.
Introduction
O glycocalyx é uma camada endotelial extracelular de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem a íntima vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL) que regula várias funções endoteliais incluindo a permeabilidade do fluido 1, neutrófilos endotelial adesão 2, e a tensão de 3 mecanotransdução fluido de cisalhamento.
Historicamente, tem sido o glicocálice underappreciated devido à sua aberrance em preparações de células de cultura 4, 5 e a sua degradação durante a fixação do tecido normal e de processamento 6. O uso crescente de 7 microscopia intravital (em microscopia vivo, IVM) coincidiu com elevado interesse científico na importância do ESL para a função vascular durante a saúde e na doença. O ESL é invisível para microscopia de luz e não pode ser facilmente rotulado devivo, dada a propensão do glicocálice fluorescentes de ligação de lectinas para provocar a aglutinação de glóbulos vermelhos 8 e embolia pulmonar fatal (observações não publicadas). Várias abordagens indiretas, por isso, foi desenvolvido para deduzir ESL espessura (e, por extensão, a integridade glicocálice), não-móveis leitos vasculares, como os microcirculations cremastérico e mesentérica. Estas técnicas incluem a medição de diferenças de velocidade de circulação de micropartículas como uma função da distância a partir da membrana endotelial (velocimetria de micropartículas imagem 9), bem como a medição da exclusão de volumosos, fluorescentemente marcadas com marcadores vasculares (por exemplo, dextranos), a partir da superfície endotelial (técnica de exclusão de dextrano 10, 11). Destas técnicas, apenas a exclusão de dextrano é capaz de estimar a espessura ESL partir de medições feitas em um único ponto no tempo. Ao medir simultaneamente larguras vasculares utilizando microscopia de campo claro (a largura emclusive do "invisível" ESL) e microscopia de fluorescência de um marcador vascular excluídos do ESL, ESL espessura pode ser calculada como a metade da diferença entre as larguras vasculares 2.
O uso de uma medida instantânea de espessura ESL é bem adequado para o estudo do glicocálice pulmonar. Microscopia intravital do pulmão é um desafio, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Embora os avanços recentes permitem a imobilização dos pulmões do rato, in vivo 12, 13, existam preocupações quanto ao impacto fisiológico do pulmão estase. Imobilidade pulmonar está associado com o óxido nítrico endotelial diminuiu de sinalização 14, uma via de sinalização que afeta tanto a adesão de neutrófilos e lesão pulmonar 15 16. Além disso, a imobilização de uma área de pulmão expõe circundante alvéolos móveis prejudiciais forças de cisalhamento (o chamado "atelectrauma"), de acordo com os conceitos clássicos fisiológicosinterdependência alveolar 17.
Em 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e seus colegas desenvolveram uma técnica cirúrgica que permite microscopia intravital de um pulmão de rato livremente em movimento 18. Artefato respiratória decorrente desta técnica pode ser negada pela utilização de imagens em alta velocidade, incluindo a medição simultânea de campo claro e microscopia de fluorescência. Neste relatório, como pormenor, a exclusão de imagem instantânea de dextrano pode ser utilizado para medir a espessura ESL na microcirculação subpleural do pulmão do rato livremente movendo, in vivo. Esta técnica pode ser facilmente modificado para determinar a função glicocálice, especificamente, a capacidade de um intacto ESL para excluir circulante elementos a partir da superfície endotelial. Recentemente temos usado essas técnicas para determinar a importância da integridade ESL pulmonar para o desenvolvimento de lesão pulmonar aguda durante as doenças inflamatórias sistémicas tais como sépsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coincidente com a crescente utilização de microscopia em vivo, não há reconhecimento crescente de tanto o tamanho substancial do ESL, bem como as suas numerosas contribuições para a função vascular. Estes dados emergentes, no entanto, são principalmente derivados de estudos do sistema vascular sistémica. Na verdade, o uso de em microscopia vivo no pulmão é tecnicamente desafiador, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca.
Vários últi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Universidade de Toronto) para a instrução sobre microscopia intravital. Agradecemos Andrew Cahill (Nikon Instruments) para obter ajuda na concepção e implementação de microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (para EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
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