In vivo Mätning av mus Pulmonary Endothelial ytskikt
Summary
Den endotel glykokalyx / endoteliala ytskiktet är idealiskt studeras med hjälp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi är tekniskt utmanande på ett rörligt organ såsom lungan. Vi visar hur samtidig ljusfält och fluorescensmikroskopi kan användas för att uppskatta endotel tjocklek ytskikt i en fritt röra<em> In vivo</em> Muslunga.
Abstract
Den endoteliala glykokalyx är ett skikt av proteoglykaner och tillhörande glykosaminoglykaner kantar vaskulära lumen. In vivo är glykocalyx mycket hydratiserade, bildar en betydande endotelial ytskikt (ESL) som bidrar till att upprätthålla endotelfunktion. Eftersom endoteliala glykokalyx ofta avvikande in vitro och förloras under standardtekniker vävnad fixering kräver studie av ESL användning av intravital mikroskopi. För att bäst approximerar komplexa fysiologi alveolära mikrovaskulaturen är pulmonell intravital avbildning helst utförs på en fritt rörlig lunga. Dessa preparat är dock typiskt lider omfattande rörelseartefakt. Vi visar hur slutna kista intravital mikroskopi av en fritt rörlig-muslunga kan användas för att mäta glykokalyx integritet genom ESL uteslutning av fluorescensmärkta högmolekylära dextraner från endotelytan. Denna icke-recovery kirurgisk teknik, som kräversamtidig ljusfält och fluorescerande avbildning av muslunga, möjliggör longitudinell observation av subpleural mikrovaskulaturen utan tecken på att framkalla confounding lungskada.
Introduction
Den endoteliala glykokalyx är en extracellulär skikt av proteoglykaner och tillhörande glykosaminoglykaner kantar vaskulära intiman. In vivo är glykocalyx mycket hydratiserade, bildar en betydande endotelial ytskikt (ESL) som reglerar en mängd endoteliala funktioner inklusive fluidumpermeabilitet 1, neutrofil-endotel vidhäftning 2, och mechanotransduction av vätska skjuvspänning 3.
Historiskt har glykokalyx varit underskattad på grund av dess aberrance i odlade cellpreparat 4, 5 och dess nedbrytning under vanlig vävnad fixering och bearbetning 6. Den ökande användningen 7 av intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) har sammanfallit med ökad vetenskaplig intresse för betydelsen av ESL till vaskulär funktion under hälsa och sjukdom. ESL är osynlig för ljusmikroskopi och kan inte lätt märkasvivo tanke benägenhet fluorescerande glykokalyx-bindande lektiner för att orsaka agglutination RBC 8 och dödlig lungemboli (opublicerade observationer). Flera indirekta metoder har därför utvecklats för att härleda ESL tjocklek (och i förlängningen glykokalyx integritet) i icke-rörliga kärlbäddar såsom cremasteric och mesenteriska microcirculations. Dessa tekniker inkluderar mätning av skillnader i cirkulerande mikropartikel hastighet som en funktion av avståndet från endoteliala membranet (mikropartikel bild velocimetry 9) samt mätning av uteslutandet av skrymmande, fluorescensmärkta vaskulära markörer (t.ex. dextraner) från endotelytan (dextran uteslutning teknik 10, 11). Av dessa tekniker är bara dextran utanförskap som kan uppskatta ESL tjocklek från mätningar gjorda på en enda tidpunkt. Genom att samtidigt mäta vaskulära bredder med brightfield mikroskopi (en bredd iclusive av "osynliga" ESL) och fluorescensmikroskopi av en vaskulär spårämne uteslutits från ESL, kan ESL tjocklek beräknas som hälften av skillnaden mellan vaskulära bredder 2.
Användningen av en momentan mätning av ESL tjocklek är väl lämpad för studier av pulmonell glykokalyx. Intravital mikroskopi av lungan är utmanande, med tanke på betydande pulmonell och hjärt rörelseartefakt. Medan nya framsteg tillåter immobilisering av mus lungor in vivo 12, 13, existerar oro över fysiologiska effekterna av lung stasis. Lung orörlighet är förknippad med minskad endotelial kväveoxid signalering 14, en signalväg som påverkar både neutrofiladhesion 15 och lungskada 16. Dessutom, immobilisering av ett område av lungan exponerar omgivande mobila alveoler till skadliga skjuvkrafter (så kallade "atelectrauma"), i enlighet med de klassiska fysiologiska begreppenalveolär beroende 17.
Under 2008 utvecklade Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler och kollegor en kirurgisk teknik som möjliggör intravital mikroskopi av ett fritt rörlig muslunga 18. Andningsskydd artefakt till följd av denna teknik kan förnekas genom användning av hög hastighet avbildning, inklusive samtidig mätning av ljusfält och fluorescensmikroskopi. I denna rapport, detalj vi hur momentant dextran uteslutning avbildning kan användas för att mäta ESL tjocklek i subpleural mikrocirkulationen av en fritt röra in vivo mus lunga. Denna teknik kan enkelt modifieras för att bestämma glykokalyx funktion-specifikt, förmågan hos en intakt ESL utesluta cirkulerande element från endotelytan. Vi har nyligen använt dessa tekniker för att bestämma vikten av pulmonell ESL integritet till utvecklingen av akut lungskada under systemiska inflammatoriska sjukdomar såsom sepsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
I samband med den ökade användningen av in vivo-mikroskopi, det finns en ökad uppskattning för både den betydande storleken av ESL liksom dess många bidrag till vaskulär funktion. Dessa nya uppgifter, men främst härrör från studier av den systemiska kärlsystemet. Faktum användning av in vivo mikroskopi i lungan är tekniskt utmanande, med tanke på betydande pulmonell och hjärt rörelseartefakt.
Flera nya tekniska framsteg har gjort det möjligt för stabilise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Arata Tabuchi och Wolfgang Kuebler (University of Toronto) för undervisning om intravital mikroskopi. Vi tackar Andrew Cahill (Nikon Instruments) för hjälp med mikroskopi utformning och genomförande. Detta arbete har finansierats av NIH / NHLBI bidrag P30 HL101295 och K08 HL105538 (till EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
