三维成像伤害表皮内神经纤维在人体皮肤活检
Summary
为了研究伤害表皮内神经纤维（IENFs）在痛苦神经病（PN）的变化，我们开发的协议，可以直接检查观察伤害IENFs的三维形态变化。三维分析IENFs的有潜力评估的形态变化IENF PN。
Abstract
一拳的皮肤活检是常用的量化表皮内神经纤维密度（IENFD）的周边多发性神经病变的诊断1,2。目前，通常的作法是，以收集从小腿远端（DL）和近端大腿长度依赖多神经病的评价3（PT）中的3毫米的皮肤活组织切片检查。然而，由于多向性质IENFs，它是具有挑战性的研究通过分析重叠的神经结构的二维（2D）成像。另外，三维（3D）成像，可以提供一个更好的解决方案，这种困境。
在目前的报告中，我们提出了应用三维成像的方法研究痛性神经病变（PN）。为了拣选IENFs的，皮肤样本进行处理的蛋白基因产物9.5（PGP），锅的神经元的标记物的免疫荧光分析。目前，标准做法是诊断小纤维神经病使用IENFD阻止使用PGP免疫组化开采的明视场显微镜4。在目前的研究中，我们采用双重免疫分析识别总IENFD，使用PGP，痛觉IENF，通过使用抗体，承认原肌球蛋白受体激酶A（TRK），高亲和力受体的神经生长因子5。 PGP和TRK A抗体共同染色IENF与优势，有利于PN明确PGP阳性，痛觉纤维染色的研究。这些荧光信号可以被量化，以确定的伤害IENFD及形态学的影响IENF与PN。荧光共聚焦显微镜图像采集和3D分析处理。 3D成像提供了旋转的能力，以进一步分析与PN相关的形态学变化。两者合计，荧光染色，共聚焦成像和3D分析明显受益PN的研究。
Introduction
目前，通常的做法是从皮肤打孔活检，可用于诊断小纤维神经病6-8医师量化表皮内神经纤维密度，（IENFD）。活检取自小腿远端（DL），10厘米以上外踝，和大腿近端（PT），20厘米以下的髂前上棘9。 ，所有IENF标记蛋白基因产物9.5（PGP），泛神经标记10-12。目前，标准做法是小纤维神经病诊断确定由PGP染色与明视场显微镜6 IENFD。此外，一些研究小组已经使用PGP免疫组化免疫协议7-9。小纤维神经病变通常伴有神经性疼痛。为了进一步了解必不可少的疼痛处理IENF的作用，我们制定了技术合作标签总IENF的纤维，产生疼痛。 Nocicep略去IENF，特别是Aδ和C纤维，可以研究通过使用PGP IENF标签和痛觉标记，原肌球蛋白受体激酶A（TRK）5。蒂尔克是伤害性的发展是必不可少的神经生长因子的高亲和力受体。 A-阳性的TRK痛觉神经纤维肽纤维快递P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）。此前，劳里亚和他的同事们采用双标记技术，研究PN，共同标签PGP阳性IENF与疼痛标记10。在我们以前的研究中，我们证实蒂尔克A-阳性IENF，但不是蒂尔克A-负面IENF的，上调糖尿病痛性神经病变的动物模型。这个共同标签技术提供了比较量化痛觉IENFD的，总IENFD和学习能力与PN相关的形态学变化的能力。可视的痛觉IENF和COMPA能力，重新量化总IENFD到痛觉IENFD的疼痛的存在可以提供客观的证据，并有可能洞察疼痛的严重程度与PN。这种技术也适用于皮肤的动物模型。在以往的研究相比，目前的协议描述为3D图像分析的方法，创造了机会，以避免错误可能发生在2D图像分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
测量IENFD已被广泛用于周围神经病变13,14的程度来决定。目前，最常用的协议仅用于测量神经纤维的密度，穿透基底膜的表皮，它并没有考虑到轴突分枝和/或神经的形态变化。此外，还没有被证明电流IENFD分析与疼痛的存在PN 15相关联IENFD的。
我们以前报道，都与在db / db小鼠的疼痛行为，2型糖尿病的小鼠模型增加的痛觉IENFD的数字。在该报告中，我们首先采用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院资助的支持K08 NS061039-01A2，神经学研究发现，和A.阿尔弗雷德·陶布曼医学研究所在密歇根大学的计划。这项工作用了密歇根州的糖尿病研究和培训中心，由国家卫生部授予5P90 DK-20572研究院从国家糖尿病，消化道和肾脏疾病研究所资助的形态和图像分析核心。笔者想感谢罗宾逊的Singleton和戈登史密斯（犹他州大学）的慷慨捐款支持初始伤害性的生物标志物免疫组化技术的发展，人类皮肤样本。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
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