Summary
Monocythärledda makrofager är viktiga celler av det medfödda immunförsvaret. Här beskriver vi en lättanvänd
Abstract
Monocythärledda makrofager är en viktig celltyp av det medfödda immunförsvaret. Musmodeller studerar makrofag biologi lider fenotypiska och funktionella skillnader mellan murina och humana monocythärledda makrofager. Därför beskriver vi här en in vitro-modell för att skapa och studera primära humana makrofager. Kortfattat, efter densitetsgradientcentrifugering av perifert blod från en underarm ven är monocyter isolerade från perifert blod mononukleära celler med användning av negativ magnetisk pärla isolering. Dessa monocyter odlas sedan i sex dagar under specifika förhållanden för att framkalla olika typer av makrofagdifferentiering eller polarisation. Modellen är enkel att använda och kringgår de problem som orsakas av artspecifika skillnader mellan mus och människa. Vidare är den närmare den in vivo-betingelser än användningen av odödliggjorda cellinjer. Sammanfattningsvis är den modell som beskrivs här lämpar sig för att studera macrophage biologi, identifiera sjukdomsmekanismer och nya terapeutiska mål. Även om inte helt ersätta experiment med djur eller mänskliga vävnader erhållna obduktion, låter den modell som beskrivs här identifiering och validering av sjukdomsmekanismer och terapeutiska mål som kan vara mycket relevant för olika mänskliga sjukdomar.
Introduction
Monocythärledda makrofager är en viktig cellulär del av det medfödda immunförsvaret och bidra till många akuta eller kroniska inflammatoriska processer 1. Makrofager spelar en viktig roll i många inflammatoriska sjukdomar som ateroskleros eller cancer 2. Makrofager visar en hög grad av plasticitet och kan anta olika fenotyper beroende på lokala micromilieu 3. Således, studera makrofagdifferentiering och heterogenitet är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid många sjukdomar och för att möjliggöra identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya behandlingsmetoder.
I många fall används murina modeller användes för att undersöka patofysiologin av specifika sjukdomar. Men studerar makrofag biologi med musmodeller tillsammans med flera brister: (1) Andelen leukocyt delmängd tal (dvs. monocyter och granulocyter) i peripheral blod av möss eller människor skiljer sig avsevärt föreslå olika roller monocyter i murina och humana patofysiologi. (2) Det finns stora skillnader i genuttryck mellan murina och humana perifera blodmonocyter tyder betydande skillnader i deras funktion under hälsa och sjukdom 4. (3) Ett antal markörer som används för att identifiera murina monocyter och makrofager (F4/80, LYC, osv.) Inte existerar i mänskliga myeloidceller, gör överföringen av resultaten i musmodeller för mänskliga situationen ganska svårt.
Således, för att öka vår förståelse av makrofag differentiering och heterogenitet i mänsklig sjukdom, måste vi använda modeller som arbetar med mänskliga makrofager. Därför beskriver vi här en modell av human primär makrofag generation som är enkel att använda och möjliggör studiet av mänskliga monocythärledda makrofager in vitro under olika tillstånd som leder till olika makrofag posation typer. I flera studier har vi använt den in vitro-modell av monocythärledda primära humana makrofager att analysera makrofag biologi och dess potentiella betydelse för människors ateroskleros 5-7.
Även om inte helt ersätta experiment med djur eller mänskliga vävnader erhållna obduktion, låter den modell som beskrivs här identifiering och validering av sjukdomsmekanismer och terapeutiska mål som kan vara mycket relevant för olika mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Protokoll
- Förbered Buffertar som följer:
- Förbered buffert för PBMC isolering: "Tvätta buffer" = 0,02% EDTA i PBS (använd 0,5 M EDTA).
- Förbered buffert för monocyt isolering: "MACS sköljning buffert" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 | il) + PBS (50 ml). Degas bufferten.
- Förbered buffert för FACS-färgning och lagring av celler: "FACS-buffert" = 10% FCS i PBS och "fixering buffert" = 1% PFA i PBS.
- Rita 30 ml helblod från en underarm ven. Använd EDTA som antikoagulant.
- Isolera PBMC (histopaque) enligt följande:
- Bered två sterila 50 ml rör (ingen poly-styren).
- Späd blod från steg 2 med PBS 01:01.
- Tillsätt 25 ml histopaque + 25 ml helblod / PBS per rör. Kontrollera att HISTOPAQUE och blod inte blandas.
- Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid RT, ingen broms.
- Aspirera plasma och kasta.
- Aspirera ogenomskinlig gränssnitt och pipett i ren 50 ml tube.
- Tillsätt 20 ml 0,02% EDTA i PBS.
- Centrifugera vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml av 0,02% EDTA i PBS.
- Räkna cellerna på följande sätt:
- Blanda väl genom att vortexa i 10 sek.
- Ta 200 pl cellsuspension + 300 ^ 0,02% EDTA i PBS + 500 pl Trypanblått (200-500 celler/10 rutor, ändra annars utspädningsfaktor).
- Utför negativ isolering av monocyter enligt följande:
- Centrifugera celler som erhållits i steg 3.10 i 10 min, 120 x g. Kassera supernatanten.
- Tvätta cellpelleten 2x genom tillsats av 10 ml PBS + 0,02% EDTA och centrifugera i 10 min, 120 x g.
- Lägg 9 ml sterilt vatten för 3 sek, tillsätt 1 ml 10X PBS.
- Tvätta en gång med PBS + 0,02% EDTA och centrifugera 10 min, 120 x g.
- Räkna under centrifugering.
- Späd i EasySep buffert vid 5 x 10 7 / ml.
- Tillsätt 50 l / ml monocyte anrikning kuksvans.
- Inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
- Vortex pärlor för 30 sek.
- Lägg 50 | il / ml pärlor.
- Inkubera i 5 minuter vid 4 ° C.
- Fyll upp med EasySep buffert för att slutföra volym av 2,5 ml. Lösningen verkar nu brunaktig.
- Sätt in magnet.
- Vänta 2,5 minuter vid RT. Under denna tid icke-monocytiska celler bundna till magnetiska pärlor kommer att flytta till rörväggen och fastnar där.
- Häll buffert med icke-bindande monocyter i färskt sterilt rör. Denna lösning ser vitaktig.
- Tvätta en gång med PBS + 0,02% EDTA och centrifugera i 10 min, 120 x g.
- Plate celler i en plastskål eller flerbladiga platta vid en densitet av 0,5 x 10 6 / cm 2. Tillsätt 1 ml av odlingsmedier / 1 x 10 6 celler.
- Kultur celler under förhållanden av intresse för 6-14 dagar.
- Ändra media efter 3 dagar genom att ersätta 50% av media med färskt medium (se tabell 1 för detaljer).
- Efter sex dagars skörd celler för mRNA isolering, flödescytometri, Western blotting, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av det protokoll som beskrivs ovan, får vi rutinmässigt 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml blod (medelvärde ± standardfel från 26 oberoende experiment, Figur 1A). Monocyt renhet enligt bestämning med flödescytometrisk färgning för CD14 är rutinmässigt större än 95% (97,1 ± 0,4%, medelvärde ± standardfel från tre oberoende experiment, Figur 1B). Cellviabilitet av nyligen isolerade monocyter enligt bestämning med trypanblått-färgning är rutinmässigt större än 95% (data ej visade). Medan initialt celler är runda-formade och flyta, börjar de vanligtvis vidhäftning inom några timmar. Adherence är associerad med en formförändring mot en "stekt ägg" eller spindel-liknande form (figur 2). Efter sex dagar i odling med M-CSF (100 ng / ml) med eller utan tillsats av oxiderat LDL (100 ^ g / ml för den sista 24 h), ungefär 80% av cellerna som inte exponerats för oxLDL är livskraftiga, medan Treatment med oxLDL resulterade i cirka 70% viabla celler (Figur 3). Flödescytometri efter sex dagars odling med M-CSF visar att medan cellerna hålla uttrycker leukocyt markör CD45RO, de nedreglera monocyt markör CD14 (fig 4). Särskilda villkor kan inducera makrofag polarisering - alltså M1-eller M2-polariserade makrofager uttrycker typiska markörer som IL-6, TNF-alfa (M1) eller CD36 och CD206 (M2) (Figur 5). Makrofager kan vidare studeras i funktionella experiment. Till exempel, kan upptaget av oxiderat LDL kan studeras med hjälp av fluorescerande etiketter LDL (Figur 6).
Figur 1. (A) Antal perifera monocyter erhållna efter negativ pärla isolering. Cell nummer normaliserad för 100 ml av perifert blod. Data för 26 oberoende experiment. (B) Renhet av monocyter erhölls med användning av negativ pärla isolering såsom bestämt genom flödescytometri. Representant framsidan punktdiagram och histogram av CD14-färgning, negativ kontroll visas som streckade linjen.
Figur 2. Celler efter 3 och 6 dagars odling med M-CSF. Skala bar = 50 pm.
Figur 3. Viabilitet av makrofager efter 6 dagar i odling med M-CSF eller efter 6 dagar i odling med M-CSF och oxLDL (100 ^ g / ml) tillsattes för den sista 24 tim enligt bestämning med propidiumjodid (PI)-färgning. Representant främre sida scAtter tomter och histogram för PI färgning.
Figur 4. Flödescytometri för monocyt markör CD14 på nyligen isolerade monocyter eller monocythärledda makrofager efter sex dagar i odling med M-CSF (100 ng / ml).
Figur 5. Gene expression av IL-6, TNF-alfa, CD36 och CD206 (mannosreceptor) i primära humana makrofager differentierade med M-CSF (100 ng / ml, 6 dagar) och den polariserade mot en M1 fenotyp (LPS, 100 ng / ml , och IFN-y, 20 ng / ml, för den sista 18 h) eller M2 (IL-4, 20 ng / ml för den sista 18 h). genuttryck varmätt med kvantitativ PCR. * P <0,05, ** P <0,01.
Figur 6. (A) Immunofluorescens bild av M-CSF-inducerade makrofager humana makrofager. Celler exponerades för 10 pg / ml Dil-märkt oxLDL under 4 timmar. Kärnor färgades med DAPI. Skala bar = 50 pm. (B) Representant histogram av flödescytometrisk mätning av Dil-oxLDL upptag av M-CSF-inducerade humana makrofager. Grå = obehandlad kontroll, svart linje = oxLDL-behandlade makrofager.
| Typ | Villkor | Ref |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-ox | 12 | |
| Andra makrofag typer |
| 13 |
Tabell 1. Exempel på förhållanden och typiska markörer för etablerade M1 eller M2 typer makrofag polarisering (se referenser för specifika isoleringsprocedurer eller cell odlingsbetingelser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monocythärledda makrofager utgör det avgörande celltypen av det medfödda immunförsvaret. De spelar en viktig roll i många inflammatoriska sjukdomar innefattande ateroskleros eller cancer 2. Således, studera makrofag biologi är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid många sjukdomar och för att möjliggöra utveckling av nya behandlingsmetoder.
Många studier tillämpas av musmodeller överuttryck eller saknar vissa gener av intresse. I fallet med monocythärledda makrofager, verkar detta inte det bästa sättet att studera processer relevanta för mänskliga sjukdomar som det finns betydande skillnader mellan murina och humana monocyter och monocythärledda celler 4. Således godkända modeller som använder sig av primära humana celler verkar ett bra alternativ för att studera sjukdomen-mekanismer för makrofagdifferentiering.
En klar fördel med den in vitro-modell som presenteras här är att det inte är beroende av immortalized cellinjer som THP-1 eller andra 14-15. Medan cellinjer kan lätt erhållas och kringgå behovet av regelbundna blod drar, cellinjer är fenotypiskt och funktionellt inte identisk med primära celler. Således, Cho et al. Har jämfört genen underskrifter primära humana makrofager och jämfört dem med tidigare publicerade uppgifter från THP-1 12,14. De fann en signifikant, men måttlig korrelation mellan de båda celltyperna som tyder på att THP-1 celler inte kan vara den idealiska modellen för att studera makrofager differentiering och heterogenitet i många fall. Dessutom finns det olika modeller hur att skilja icke-vidhäftande monocyt-liknande THP-1 celler mot makrofager. Även när du använder förmodligen mest tillämpliga protokoll där THP-1 celler behandlas med PMA följt av fem dagar vilar i kultur utan PMA (PMAR), gör cellerna inte helt beter sig som primära celler 16. Sammantaget visar dessa fynd tyder på att för studier av sjukdomar hos människormekanismer på cellnivå, primära makrofager verkar mer lämpade än cellinjer.
Man måste vara medveten om andra metoder som gör att isolering av primära humana monocyter: vidhäftning till plast, positiv pärla isolering, eller motströms centrifugering slamning 17. Den monocyte anrikningscocktail används här innehåller antikroppar mot CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glykoforin A och dextran-belagda magnetiska partiklar. Dessa antikroppar binder till epitoper på leukocyter än monocyter som sedan kan binda de magnetiska partiklarna och hålls i röret genom magnetfältet medan allt obundet monocyte kan överföras till ett andra rör. Vidare innehåller anrikningscocktail antikropp till humana Fc-receptorer (som är mycket uttrycks av monocyter) som förhindrar icke-specifik bindning till monocyter. Följaktligen ger den metod som presenteras här "orörda" icke-aktiverade monocyter med en hög grad av renhet.
Det finns några punkter som måste hållas i åtanke vid tillämpningen av denna modell. Ficoll / Histopaque centrifugeringen bör utföras vid rumstemperatur. EDTA i tvättbufferten is krävs för att inhibera integrin-beroende bindning av trombocyter till monocyter. Det är viktigt att frö monocytema vid rätt densitet i syfte att uppnå optimal differentiering. Båda seedning monocyter för löst eller för tätt resulterar i suboptimal tillväxt och differentiering. Alternativ för förändringar inkluderar ympning av celler på specifika substrat eller med användning av olika tillväxtfaktorer (t ex GM-CSF 18) eller tillsats av specifika cell-aktivatorer (t.ex. cytokiner eller LPS 8, tabell 1).
Använda celler från olika individer kan leda till en högre grad av variation avseende specifika cellulära funktioner. Sålunda Martin-Fuentes et al. Har visat att monocythärledda makrofager från olika individer visa olika kapacitet LDL-upptag 19. Intressant, dessa skillnader är stabila över tiden tyder på att variationen mellan celler från olika givare är intepå grund av olika experimentella förhållanden, utan snarare återspeglar individuella genetiska eller epigenetiska skillnader. Å ena sidan kräver det större variation större antal för att uppnå betydande resultat i specifika experiment som oxLDL upptag. Däremot dessa skillnader gör det också möjligt för forskare att studera skillnader mellan friska och sjuka individer på cellnivå och därmed avslöja mekanismerna nya sjukdomsgener.
Totalt sett är det protokoll som beskrivs här lätt att använda, reproducerbar, och nyttigt att få extremt rena monocytpopulationernas som sedan kan differentieras till makrofager. Beroende på odlingsbetingelser, kan olika typer av monocythärledda makrofager studeras möjliggör identifiering av specifika fysiologiska eller patofysiologiska processer som är relevanta för människors sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna behöver inte avslöja någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Nadine Wambsganss för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) och delvis genom bidrag från Innovation Fund gräns (University of Heidelberg) till CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
