Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l'uso con sezionato espianti cerebrali corticali
Summary
Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell'embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.
Abstract
Il QCS è un fluido complesso con una proteoma varia dinamicamente durante tutto lo sviluppo e in età adulta. Durante lo sviluppo embrionale, il QCS nascente differenzia dal liquido amniotico alla chiusura del tubo neurale anteriore. Volume di CSF aumenta poi nei giorni successivi, come le cellule progenitrici neuroepiteliale che rivestono i ventricoli e del plesso coroide generate CSF. I contatti embrionali CSF apicale, superficie ventricolare delle cellule staminali neurali del cervello in via di sviluppo e il midollo spinale. CSF fornisce la pressione del fluido cruciale per l'espansione del cervello sviluppo e distribuisce crescita importante promuovere fattori di cellule progenitrici neurali temporalmente in un modo specifico. Per studiare la funzione del CSF, è importante isolare campioni puri di embrionale CSF senza contaminazione da sangue o tessuto telencephalic sviluppo. Qui, si descrive una tecnica per isolare campioni relativamente puri ventricolare embrionale CSF che possono essere utilizzati perun'ampia gamma di saggi sperimentali compresi spettrometria di massa, elettroforesi proteica, e coltura di cellule e espianto primaria. Dimostriamo come sezionare e cultura espianti corticali su membrane porose in policarbonato per crescere sviluppo del tessuto corticale con ridotti volumi di supporto o nel liquido cerebrospinale. Con questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando CSF da varie età o condizioni per studiare l'attività biologica del proteoma CSF sulle cellule bersaglio.
Introduction
Il QCS è un fluido complesso che bagna la neuroepitelio sviluppo 1-6 e offre 7 essenziali pressione e promuovere la crescita spunti per lo sviluppo del cervello 8-12. Per studiare il QCS nel corso dello sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato tecniche per isolare liquor ventricolare di sviluppare embrioni di ratto o il mouse durante le varie fasi di sviluppo 6,9. Metodi precedenti di isolamento incluso con una lente di micro-ago e isolamento del QCS con un micro-iniettore 1,2. Il nostro metodo utilizza un micro-capillare pipetta di vetro la cui punta è stato tirato per creare un punto ultrafine per la penetrazione nel tessuto migliore. Il micro-capillare pipetta di vetro è collegato ad un aspiratore modo che la raccolta liquor ventricolare può essere controllato con cambiamenti nella pressione dolci. Per studiare l'influenza delle cellule staminali di segnali CSF, si sezionare cerebrali corticali espianti, disporle su membrane in policarbonato, e galleggiare li cu appropriatemedia lture integrato con campioni di CSF 9. Con questa tecnica, ridotti volumi di supporti sono sufficienti per la coltura tissutale, consentendo un uso efficiente di CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto per la raccolta ventricolare CSF ha prodotto campioni relativamente puri embrionale CSF con composizione proteica stabile e consistente attività in un certo numero di saggi cellulari 9. Con una tecnica buona raccolta e la prole di dieci E14.5 topi, ci si può aspettare di raccogliere 10-15 ml di CSF, e da una cucciolata di ratti E16, si può aspettare di raccogliere circa 50-90 ml di liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta minimizza la contaminazione da sangue e dei tessuti, at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il sostegno del NIH (numeri di aggiudicazione R00 NS072192 a MKL, HD029178 a AS.L., e 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL è il destinatario l'Ospedale dei Bambini di Boston Career Development Fellowship / Harvard Fellowship Shore Medical School e membro della Alfred P. Sloan Foundation. CAW è un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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