Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Summary

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Abstract

Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Nukleosomalen Arrays werden in einem von zwei Wegen erreicht: Reinigung von in vivo-Quellen oder in vitro Rekonstitution von rekombinantem Core-Histone und tandemartig wiederholten DNA Nukleosom Positionierung. Das letztere Verfahren hat den Vorteil, dass für die Montage von einer in der Zusammensetzung einheitlich und genau positioniert nukleosomalen Array. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen durch die Analyse der Geschwindigkeit, mit der sie durch Lösung unter Zentrifugalkraft migrieren. Diese Technik, die zusammen mit der Rasterkraftmikroskopie kann zur Qualitätskontrolle verwendet werden, so dass der Großteil der DNA-Templates werden mit Nukleosomen nach Rekonstitution gesättigt. Hier beschreiben wir die erforderlichen Milligramm-Mengen der Länge und der Zusammensetzung zu rekonstituieren d Protokolleefined nukleosomalen Arrays für biochemische und biophysikalische Untersuchungen der Chromatin-Struktur und Funktion.

Introduction

Eukaryotischen Genomen existieren nicht als nackte DNA, sondern verdichtet und durch gebundene Proteine ​​organisiert. Diese Komplexe von DNA und Protein Chromatin. Die Grundstruktureinheit des Chromatins ist das Nukleosom. Ein Nukleosom umfasst Histonoktamer und 146 Basenpaare der DNA um die Histon-Oktamer gewickelt etwa 1,6 mal ^1. Die Histonoktamer wird von jedem der Core-Histone H2A, H2B, H3, H4 und zwei Kopien zusammen. Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Die erweiterte Struktur nukleosomalen Arrays hat als die 10 nm-Faser oder den "Perlen auf einer Schnur"-Struktur bezeichnet worden ist und in vitro unter Niedrigsalzbedingungen ² vorhanden. Die 10-nm-Faser ist in der Lage Kondensation in Strukturen höherer Ordnung durch intra-Array Verdichtung und / oder Inter-Array Oligomerisierung ^2. Diese Strukturen höherer Ordnung in Gegenwart von Salzen induziert werden,oder durch die Bindung von Proteinen an Chromatin Architektur nukleosomalen Array ^3,4 beeinflusst werden. Levels Verdichtung des Chromatins sind invers mit Transkriptionsrate in vivo ^5,6 korreliert. Neue Forschung unterstreicht die Bedeutung der strukturellen Organisation der Genome in Prozesse wie Differenzierung, die Entwicklung von Krebs, und andere ^7,8. Der Einsatz von Arrays nukleosomalen Chromatin Struktur und Funktion zu untersuchen hat sich weit verbreitet. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Montage von nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und Nukleosomen Positionierung DNA.

Mit Hilfe rekombinanter DNA mit Tandem-Wiederholungen von Nukleosomen-Positionierung Sequenzen ermöglicht die Wiederherstellung des Arrays, die regelmäßig angeordneten Nukleosomen enthalten. Zwei der populäreren Positionierung Sequenzen sind die 5S-rRNA-Gen-Sequenz und die "601"-Sequenz ^9,10. Die 601-Sequenz wurde aus SELEX-Experimenten und mor abgeleitete-Positionen stark Nukleosomen als die 5S-Sequenz ^11. Folglich ist die Linker-DNA Länge der Arrays 601 homogener. Tandemwiederholungen Nukleosom Positionierung DNA durch Gelfiltration ^4,12 erhalten. Rekombinante Histone werden von E. gereinigt coli unter denaturierenden Bedingungen ^13. Die Verwendung von rekombinanten Histone erlaubt es, sorgfältig zu steuern, die Histon-Zusammensetzung der nukleosomalen Arrays. Zum Beispiel, Kern-Histone tragen spezifische Mutationen ¹⁴ oder post-translationale Modifikationen ^15,16 für Wildtyp-Core-Histone ersetzt werden.

Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente überwachen die Geschwindigkeit der Sedimentation von Makromolekülen in Lösung unter einer angelegten Zentrifugalkraft ^17. Dies liefert Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen in einer Probe. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente sind daher ein geeignetes Instrument für die Untersuchung Lösung Zustandsänderungen in ChromatinfaserStruktur aufgrund Chromatin-Kondensation ^18. Wichtig ist es zunächst erforderlich, Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente als Qualitätskontrollschritt in nukleosomalen Array Rekonstitution zu verwenden. Wenn DNA und Nukleosomen sind nicht in der richtigen molaren Verhältnis kombiniert, können die Arrays unter-oder übergesättigten mit Core-Histone werden. Somit werden die Informationen aus der Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente gewonnen wird verwendet, um sicherzustellen, dass die DNA richtig mit Nukleosomen gesättigt. Es ist wichtig, alternative Methoden anzuwenden, um die Sättigung der DNA mit Nukleosomen zu schätzen, vor allem, wenn die Arbeit mit einem zuvor nicht charakterisierten DNA-Vorlage. Deshalb beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse von nukleosomalen Arrays mit Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM ist eine leistungsfähige Technik, die ermöglicht die Visualisierung der Wirkungen einer Anzahl von Parametern, wie der Pegel der Sättigung Wirkung der Anwesenheit von Histon-Varianten oder die Auswirkungen von MgCl ₂ ^19,20. AFM hat auch Anwendungened, um Nukleosomen Dynamik Studie mit ^{Zeitraffer-Imaging-21.} In vitro zusammen nukleosomalen 12-mer-Arrays sind besonders geeignet, um AFM-Untersuchungen, weil sie in der richtigen Größenbereich für AFM ²² gehören. In der vorliegenden Studie haben wir von AFM nukleosomalen Arrays als Qualitätskontrolle als auch als Mittel zur Bekräftigung die Daten von AUC ("Sehen ist Glauben") eingesetzt. Neben einfachen Visualisierung ermöglicht AFM-Messung der Höhenprofile von Proben als eine zusätzliche Metrik.

Protocol

1. Montage von rekombinantem Core-Histone in Octamere Begründung: Der erste Schritt in nukleosomalen Array Rekonstitution ist es, nativen Kern Histon Octamere aus lyophilisierten rekombinanten Histone vorzubereiten. Histon-Proteine ​​werden in äquimolaren Mengen kombiniert und durch Dialyse der Proben aus einem denaturierenden Puffer in Rückfaltungspuffer in Histon Octamere montiert. Entschlacken und lyophilisiert rekombinanten Histone (H2A, H2B, H3, H4) wie beschrieben <su…

Representative Results

Um das Protokoll zu veranschaulichen wir rekonstituiert nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Xenopus Histone und DNA, die aus 12 207 bp Tandem-Wiederholungen der Folge 601 Positionierung (601 207 x 12). Wir haben zuerst zusammengebaut nativen Octamere aus lyophilisierten Histone und reinigte die Octamere durch FPLC mit einem S200-Säule (Abbildung 1A) dann. Größere Komplexe eluieren früher aus der Säule S200. Histone eluieren in der Regel in dieser Reihenfolge: nicht-spezifisch…

Discussion

Modell nukleosomalen Arrays sind ein sehr nützliches Werkzeug für die in vitro Untersuchung von Chromatin-Struktur und Funktion. Beispielsweise haben sie häufig verwendet, um den Mechanismus der Chromatinfaser Kondensation in Lösung ^30-34 untersuchen, und machte es möglich, eine Röntgenstruktur eines tetranucleosome ³⁵ erhalten. Vor kurzem haben sie nützlich bei der Entschlüsselung die strukturellen Auswirkungen der spezifischen Kern Histon-Varianten, Mutanten und posttranslational…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter