기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별
Summary
exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.
Abstract
우리의 경우 HIV-1 Nef의에, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드는 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다뿐만 아니라. 20 네프 스캔 펩티드, 각 이웃의 10 아미노산 겹치는 길이 20 아미노산의 세트는 세포 사멸의 유도에 대한 책임 네프에서 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이러한 세포 사멸 주제를 포함하는 펩티드는 전체 길이 네프 단백질에 비해 수준에서 세포 사멸을 유도. 네프의 분비 수정 지역 (SMR)에서 파생 된 두 번째 펩티드, exosomes에있는 네프의 분비 (exNef)에 관련된 세포 단백질과 상호 작용하는 능력을 유지했다. 이 SMRwt 펩타이드는 네프의 SMR 주제에 구체적으로 바인딩 세포 단백질을 분리하기 위해 공동 immunoprecipitation의 실험에서 "미끼"단백질로 사용되었다. 단백질 형질 항체 억제는 물리적 상호 작용 내기를 중단하는 데 사용되었다싸우는 네프 및 mortalin, 고립 된 SMR-결합 단백질의 하나이며, 효과는 형광 기반의 exNef 분비 분석으로 측정 하였다. SMR 모티브를 결합 세포 단백질에 대한 전체 길이 네프을 outcompete하는 SMRwt 펩타이드의 능력은, 그것 exNef 분비의 첫 억제합니다. 따라서, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 고유 한 특성을 활용하여 여기에 설명 된 기술을 채용하여, 하나는 단백질의 기능 모티프의 식별 및 병원성 기능의 펩타이드 기반 억제제의 개발을 가속화 할 수 있습니다.
Introduction
항 레트로 바이러스 치료의 도래와 함께, 서구 세계에서 에이즈 전염병이 둔화하지만, 축소하지 않으며, HIV의 확산은 전 세계에 걸쳐 중요한 건강 부담을 계속하고있다. 변두리에 효과적인 RV144 태국 재판을 제외하고, HIV 백신은 지금까지 감염으로부터 보호하기 위해 실패를 보여 주었다. 따라서, 추가, 잠재적 인 치료 표적에 대한 연구는 여전히 보증합니다.
CD4 T 세포 고갈과 함께, 지속적인 일반화 된 면역 활성화는 HIV 감염의 특징이다. 이 만성 면역 활성화 (CIA)은 세포의 매출 활성화와 차별화 된 림프 모집단, 휴대 피로와 노화, 및 활성화 유도 세포 죽음 (AICD) 1,2,3을 통해 T 세포와 B 세포의 살해의 증가로 연결하고, 그것은 잘 질병의 진행 4,5,6,7,8,9,10,11,12의 가장 강력한 예측 인자 중 하나로 설정됩니다. 그러나 메커니즘은 CIA와 CD4의 기초HIV 감염의 고갈 T-세포가 완전히 밝혀 할 수 남아 있습니다.
우리 실험실과 다른 사람의 증거는 HIV 단백질 네프는 (네거티브 규제 요인) HIV-1에 감염된 세포 13,14에서 exosomes에있는 그것의 분비를 유도 상기 질병의 진행을위한 모델 (그림 1)로 우리를 이끌었다. 이러한 네프 함유 exosomes (exNef)는 감염되지 않은 CD4 T 세포 15,16 등의 세포 계통의 여러 세포 사멸을 유도. 또한, 단핵구에서 / 대 식세포 exNef 바꾼다 유전자 발현 패턴, 예를 들면 사이토 카인의 발현, 그리고 예약되지 않은 면역 활성화의 상태를 유도하기 위해 나타납니다. 증거의이 몸은 CIA와 CD4 T 세포 고갈 exNef에 중요한 역할을 제안합니다.
exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈을 감소한다그리고 CIA 드라이브 HIV / AIDS 발병합니다.
HIV / AIDS 질병의 진행이 모델에 내장 된 다음 데이터에 대한 우리의 모델을 주도 증거를 수집하기 위해, 우리는 우리가 exNef 분비의 유전자를 분석 할 수 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발하고,을 결정하기 시작 세포 단백질이있었습니다. 초기 연구에서, 우리는 네프 단백질 방관자 세포의 apoptosis를 유도하고 네프 형질 전환 및 HIV에 감염된 세포에서 extracellularly 15 릴리스되고있는 것으로 나타났습니다. SDF-1α (대안 접합 알파 계수-1 유래 기질 세포)에서 유래 펩타이드는 이전에 많은 전장 분자 (17)의 결합 및 신호 활동을 유지하기 위해 표시했다. 우리는 네프의 펩티드는 전체 단백질의 세포 사멸 활동의 일부, 이러한 펩티드 반드시 네프 세포 사멸 도메인 (들)을 포함하는 것을 유지할 수 있다는 추측. 이러한 펩티드를 확인하고 그 결과 네프하려면세포 사멸 도메인 (들), 우리는 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에서 20 HIV-1 Nef의 스캔 펩티드의 집합을 얻었다. 이 20-AA 펩티드는 이웃의 10 아미노산 중복 각각은, 그들의 마지막 아미노산 즉, N20 걸쳐 네프 아미노산 1-20 N30 걸쳐 네프 아미노산 11-30, 등 16의 숫자로 지정됩니다. 우리는이 세포의 전체 길이 네프 단백질 유도 세포 사멸의 두 가지 10-AA 도메인을 중복 특정 펩티드 extracellularly T-세포를 노출 것을 발견했다. 이러한 네프 파생 된 세포 사멸 펩티드의 후속 분석은 실제로 이러한 펩티드 경쟁력 CXCR4와 자연의 리간드 SDF-1α 사이의 바인딩을 억제 할 수 바인딩 속도론과 T 세포의 표면에 케모카인 수용체 CXCR4와 상호 작용하는 능력을 공개했다. 마지막으로, CXCR4와 네프에서 파생 된 세포 사멸 펩티드 '상호 작용은 세포 사멸에 이르는이 T-세포의 스트레스 반응을 유발하는 것으로되었다. 이 증거는 우리에게 QUIC 허용광년지도 네프의 기능 영역, 예 알라닌 스캔 돌연변이와 같은 표준 DNA 돌연변이 기술을 사용하여 더 이상 걸렸을 것입니다 프로세스입니다. 또한 이러한 짧은 네프 파생 펩티드는 전체 길이 단백질 세포 사멸 도메인의 생물학적 기능을 유지 것을 보여 주었다.
세포 네프의 역할을 확인하는 데, T-세포 즉, 세포 사멸, 우리는 네프는 세포에서 분비 된 방법의 더 나은 이해를 모색하고 있습니다. 변이 네프 구문의 시리즈를 사용하여, 우리는 HIV 네프 모두의 N-말단 지역에서 매우 보존 네프 단백질 모티프를 매핑하고, exNef 분비 13 중요한 그 붉은 털 원숭이 해당 SIV 맥 (유인원 면역 결핍 바이러스) 네프. 이러한 주제 중 하나 분비 수정 지역 (SMR, 66VGFPV70)는 자사의 다섯 가지 아미노산의 하나 크게 exNef 분비를 감소 또는 폐지의 알라닌 교체로, 특히 중요했습니다. 활동 주제의 C를 통해 세포에 전달 될 때hariot 단백질 배달 시약, FLAG 펩타이드 시퀀스 (SMRwt)에 부착 된 SMR을 포함하는 펩타이드는 18 세포 네프 – 형질 전환 및 HIV에 감염된 모두에서 exNef 분비를 억제하는 것으로되었다. 펩티드와 우리의 이전 경험을 바탕으로, 우리는 분자와 exNef 분비 네프 SMR의 역할을 기본 메커니즘을 해명이 펩티드를 사용하기로 결정했다.
우리의 "미끼 단백질"로 SMRwt 펩티드를 사용하여, 우리는 감염되지 않은 T 세포 용 해물 (18)로부터 SMR의 휴대 전화 바인딩 파트너를 공동 immunoprecipitated. FLAG 펩타이드 시퀀스는 안티-FLAG 친 화성 수지를 사용하여 SMRwt 펩타이드를 캡처하는 편리한 손잡이를 제공했다. SMRwt 펩타이드의 돌연변이 알라닌하는 단일 발린이 exNef 분비의 억제를 폐지하기에 충분했다 우리의 이전 연구 결과는 우리가 SMR에 대한 특정하지 공동 immunoprecipitated 단백질을 배제하는 데 편리하고, 매우 구체적인 제어 펩타이드 (SMRmut)를 확인했다. s의 펩티드를 사용하여오히려 전체 길이 단백질보다 관심 pecific 도메인은 우리가 네프 19 다른 도메인에 바인딩 세포의 여러 요소의 검사를 우회 할 수있었습니다.
일단 우리는 논리적 인 다음 단계는 확인 된 휴대 전화 바인딩 파트너 생물학적 기능 18 중요하다는 것을 보여주고 있었고, SMR 결합 파트너를 확인했다. 이 작업을 수행하는 표준 절차는 생물학적 기능을 표적 단백질의 특정 miRNA의 또는 siRNA를하고, 이후 분석 결과를 사용하여 최저 단백질 수준이다. 우리는이 경우 SMR-결합 단백질에 대상의 생산을 감소 목표의 mRNA의 번역을 억제 miRNA의 넉다운을 수행. 대상 단백질이 감소 간접 효과, 그리고 아마도 타겟 단백질이 결과적 인치 역할을하는 생물학적 기능에 대한 지연 효과를 가지고, 우리는 직접의 활동을 방해하는지 확인하기 위해 덜 일반적인 항체 억제 기술을 채택대상 단백질은 생물학적 기능을 줄이거 나 제거합니다. 이 절차에서는 항체 표적 단백질에 대해 제기는 전차 시약을 사용하여 세포로 형질 전환하고, 목적 단백질도 기능을 자사의 사이트에서 봉쇄를, 또는 관련 바인딩 도메인을 차단과 직접 상호 작용합니다. 이 절차를 통해 대상 단백질의 억제가 직접 그 기능을 방해하고, 또한 생물학적 기능에 목적 단백질의 중요성을 확인하여 RNA의 최저 절차를 보완 할 수 있습니다.
전차 시약은 세포로 펩티드와 단백질을 제공하는데 효과적이지만,이 과정은 시간이 많이 소요하고, 실험의 종류를 제한하는 등 장기간 또는 반복 노출과 생체 내 동물 연구에서 수행 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 수동적으로 세포에 의해 수행 될 수있는 펩타이드를 생성하는 SMRwt 펩타이드 (SMRwt-CPP) 18 세포 관통 펩티드 (CPP) 시퀀스를 추가문화 미디어. 이 버전은 억제 exNef 분비에 이전만큼 효과적이었다.
이러한 게시 된 실험 증거는 경쟁 억제를 통해 전체 길이 단백질의 기능을 적대하고, 이러한 주제를 바인딩 단백질을 분리하기 위해 특정 기능을 모티프 포함하는 작은 펩티드의 능력을 보여줍니다. 하나는 이러한 기술은 많은 실험 프로토콜에 도움이 될 것을 기대합니다. 그들은 또한 많은 세포 과정의 엔지니어링 소설 펩티드 억제에 효과가한다 CPP 시퀀스 결합하여 성능을 더욱 향상시킬 수 있습니다 기능.
Protocol
Representative Results
Discussion
exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈과 CIA 해당 드라이브 HIV / AIDS 발병을 감소해야한다. 이 목표를 향해, 우리는 우리가 exNef 분비의 유전학을 분석하고, 관련된 세포 단백질을 결정하기 시작 허락 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발했습니다. 이 방법은 직접 exNef 분비, SMR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH / NIGMS / MBR에 (그랜트 58268), NIH / NCRR / RCMI (부여 G12-RR03034), 조지아 리서치 얼라이언스 자금을 부여 GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA 부여 F31AI091484, 모리 CFAR 교부금 P30에 의해 지원되었다 A1050409. 이 연구는 NIH / NCRR에서 연구 시설 개선 보조금 # C06 RR18386의 지원으로 건설 시설에서 실시되었다. 된 Jurkat 세포 20의 집합 HIV-1 Nef의 펩티드뿐만 아니라, 토끼 반대로 HIV-1 Nef의 항혈청은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 (락빌, MD)에서 하였다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
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