Microscopia correlativa per l'analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche
Summary
Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.
Abstract
Tomografia crio-elettroni (cryoET) permette la visualizzazione 3D delle strutture cellulari a risoluzione molecolare in uno stato prossimo al fisiologico 1. Tuttavia, visualizzazione diretta dei singoli complessi virali nel loro ambiente cellulare ospite con cryoET è impegnativo 2, a causa della natura infrequenti e dinamica di ingresso del virus, in particolare nel caso di HIV-1. Mentre time-lapse live-cell imaging ha prodotto una grande quantità di informazioni su molti aspetti del ciclo di vita del virus HIV-1 3-7, la risoluzione offerta dalla microscopia live-cell è limitata (~ 200 nm). Il nostro lavoro è stato finalizzato a sviluppare un metodo di correlazione che permette la visualizzazione diretta di eventi precoci di infezione da HIV-1, combinando live-cell a fluorescenza microscopia ottica, microscopia a crio-fluorescenza, e cryoET. In questo modo, i segnali cellule vive e crio-fluorescenti possono essere usate per guidare con precisione il campionamento in cryoET. Inoltre, le informazioni strutturali ottenute da cryoET può be integrato con i dati funzionali dinamici acquisita attraverso live-cell imaging di fluorescenza bersaglio marcato.
In questo articolo video, forniamo i dettagli sui metodi e protocolli di indagine strutturale del virus HIV-1 e interazioni ospite-cellulari utilizzando 3D live-cell imaging ad alta velocità correlativo e ad alta risoluzione cryoET analisi strutturale. Cellule HeLa infettate con HIV-1 particelle sono stati caratterizzati in primo luogo dalla microscopia confocale live-cell, e la regione che contiene la stessa particella virale è stata poi analizzati mediante tomografia crio-elettroni per i dettagli strutturali 3D. La correlazione tra le due serie di dati di imaging, imaging ottico ed elettronico di imaging, è stato realizzato utilizzando una fase microscopio ottico a fluorescenza crio-casa-costruita. L'approccio qui descritto sarà prezioso, non solo per lo studio delle interazioni delle cellule virus-ospite, ma anche per applicazioni più ampie in biologia cellulare, come la segnalazione cellulare, il traffico di recettore di membrana, e molti altri processi cellulari dinamici. </ P>
Introduction
Tomografia crio-elettroni (cryoET) è una tecnica di imaging potente che permette a tre dimensioni (3D) visualizzazione di cellule e tessuti e fornisce approfondimenti nell'organizzazione di organelli nativi e strutture cellulari a risoluzione molecolare in un close-to stato fisiologico 1. Tuttavia, il contrasto di intrinsecamente bassa macchia preparato congelato-idratato, combinata con la loro sensibilità alle radiazioni, rende difficile individuare aree di interesse all'interno di una cella e successivamente eseguire con successo la serie di inclinazione senza danneggiare l'area bersaglio. Per superare questi problemi, un approccio correlativo che combina microscopio ottico ed elettronico è necessario. Caratteristiche specifiche evidenziate dalla marcatura fluorescente vengono identificati e localizzati al microscopio ottico a fluorescenza, e quindi le loro coordinate sono trasferiti al microscopio elettronico per l'acquisizione dei dati strutturali resolution 3D elevate. Questo metodo correlativo aiuta localizzare il bersaglio unaReas di interesse da affrontare. A causa della limitazione dello spessore del campione con cryoEM (<300 nm), attualmente solo le regioni periferiche della cellula sono adatti per l'analisi strutturale 3D da CryoET. Riducendo ulteriormente lo spessore dei campioni congelati-idratato vitreo sezionamento 8 o da crio-fascio ionico focalizzato (FIB) fresatura 9 sarebbe espandere la capacità di rappresentazione correlativa.
In precedenza, i metodi correlativi sono stati utilizzati principalmente per facilitare l'acquisizione dei dati cryoET per grandi e statico delle strutture 10-13. In questi studi, sono stati implementati crio-fasi di accettare griglie cryoEM e sta su sia un microscopio verticale o di un microscopio invertito 10,11,14. Anche se il passaggio griglie sembra abbastanza semplice nei loro disegni, ci sono ulteriore trasferimento di passaggi necessari per la griglia EM, aumentando la probabilità che la griglia può essere deformato, danneggiato e contaminato. Abbiamo recentemente dimostrato un progresso tecnico inmicroscopia correlativa che ci permette di visualizzare direttamente gli eventi dinamici che sono per loro natura difficili da catturare, come l'HIV-1 e le interazioni delle cellule ospiti nelle fasi iniziali di infezione 15. Abbiamo compiuto questo attraverso la progettazione e l'attuazione di una fase di campionamento crio-microscopia luce che si adatta un sistema a cartuccia per ridurre al minimo i danni del campione a causa di manipolazione della rete, facilitando così la correlazione. Il nostro design include un supporto integrato della cartuccia campione, consentendo sia crio-microscopia luce e crio-elettroni da eseguire, in sequenza, sullo stesso supporto del campione, senza trasferimento del campione, semplificando così il processo correlativo. Inoltre, abbiamo anche implementato una procedura di correlazione precisa e affidabile utilizzando fluorescenti sfere di lattice come marker fiduciali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato una serie di semplici protocolli di fornire un approccio correlativo avanzato per analizzare gli eventi cellulari dinamici usando time-lapse imaging di fluorescenza confocale, live-cell seguita da cryoET. Il nostro sviluppo metodologico di correlare 3D live-cell imaging ad alta risoluzione cryoET è fondamentale per studiare molti problemi biologici complessi, come ad esempio la visualizzazione (non statico, come riportato in precedenza) e diffrazione di particelle rare, dinamiche limitate virali e le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Travis Wheeler e l'officina meccanica presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Fisiologia, Università di Pittsburgh per la costruzione del palco campione crio-fluorescenza, Changlu Tao e Cheng Xu presso l'Università di Scienza e Tecnologia della Cina per il tecnico assistenza, e il Dr. Teresa Brosenitsch per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
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