We beschrijven een reproduceerbare werkwijze voor het bereiden muizen acinaire cellen van een muis voor het onderzoek van acinaire cel calcium signalen en celbeschadiging met fysiologisch en pathologisch relevant stimuli. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.
Het acinaire cel het belangrijkste parenchymale cel van de exocriene pancreas en speelt een grote rol bij de secretie van pancreasenzymen in de ductus pancreaticus. Het is ook de plaats voor de initiatie van pancreatitis. Hier beschrijven we hoe acinar cellen worden geïsoleerd uit hele pancreas weefsel en intracellulair calcium signalen worden gemeten. Verder beschrijven we de technieken van deze cellen transfecteren met adenovirale constructen, en vervolgens het meten van de lekkage van lactaat dehydrogenase, een marker van celschade, in omstandigheden die acinar celbeschadiging in vitro te induceren. Deze technieken zorgen voor een krachtig hulpmiddel te karakteriseren acinar cel fysiologie en pathologie.
Dynamische veranderingen in cytosolische calcium zijn nodig voor zowel de fysiologische en pathologische acinar cel gebeurtenissen. Deze uiteenlopende effecten van calcium wordt gedacht dat het gevolg zijn van verschillende ruimtelijke en temporele patronen van calcium signalering 1. Bijvoorbeeld, enzym en secretie vloeistof uit de acinaire cel verbonden calcium pieken van een beperkt gebied van het apicale pool waar afscheiding plaatsvindt 2. In tegenstelling, is een wereldwijde calcium golf gevolgd door intense niet-oscillerende calcium signalen geassocieerd met vroege pathologische gebeurtenissen die leiden tot acute pancreatitis 3,4. Deze omvatten intra-acinar protease activering, verminderde enzym secretie, en acinar celschade. Ons laboratorium gebruikt geïsoleerde pancreatische acini deze eerste pathologische gebeurtenissen die leiden tot ziekte zowel in vivo en in vitro onderzoeken 5-7. De methoden die hier gedetailleerd beschrijven isolatie van primaire acinaire cellen voor het meten van cytosolic calciumgehalte en celschade. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.
De celisolatie methode en de daaropvolgende analyses afgeschilderd hier vertegenwoordigen krachtige instrumenten om de fysiologische en pathofysiologische kenmerken van de exocriene pancreas bestuderen. Werkwijze voor het isoleren gedispergeerde acinaire cellen werd eerst beschreven door Amsterdam en Jamieson in 1972 11. De methoden die hier gepresenteerd zijn op basis van meer recente isolatie methoden beschreven door Van Acker en collega's 12. Hoewel deze technieken zijn zeer reproduceerbaar …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health Grant DK083327 en DK093491 (tot SZH).
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase | Worthington | 4188 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
Deionized water | N/A | N/A | |
18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
Equipment | |||
Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |