Udarbejdelse af pancreas acinarceller til brug ved Calcium Imaging, celleskade Målinger og adenovirusinfektion

Summary

Vi beskriver en reproducerbar fremgangsmåde til fremstilling af muse pankreatiske acinarceller fra en mus for at undersøge acinar celle calcium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.

Abstract

Pancreas acinar celle er den vigtigste parenkyme celle af eksokrine pancreas og spiller en primær rolle i sekretion af pancreas enzymer i pancreas kanalen. Det er også stedet for at indlede pancreatitis. Her beskriver vi, hvordan acinar celler isoleres fra hele pancreas væv og intracellulære calcium signaler måles. Herudover beskriver vi de teknikker transfektion disse celler med adenovirale konstruktioner, og efterfølgende måling af udsivning af lactatdehydrogenase, en markør for celleskade under betingelser der inducerer acinar celleskade in vitro. Disse teknikker giver et kraftfuldt værktøj til at karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.

Introduction

Dynamiske ændringer i cytosolisk calcium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinar celle begivenheder. Disse forskellige effekter af calcium menes at stamme fra forskellige rumlige og tidslige mønstre af calcium signalering ^1. For eksempel enzym og væske sekretion fra acinar celle er knyttet til calcium pigge fra en begrænset område af den apikale pol hvor sekretion finder sted ^2.. I modsætning hertil er en global calcium bølge efterfulgt af intense ikke-oscillerende calcium signaler forbundet med tidlige patologiske begivenheder, der fører til akut pancreatitis ^3,4. Disse omfatter intra-acinært protease aktivering, reduceret enzym sekretion, og acinar celle skade. Vores laboratorium bruger isoleret pancreas acini at studere disse tidlige patologiske begivenheder, der fører til sygdom både in vivo og in vitro ^5-7. De beskrevne metoder her beskrive isolering af primære acinarceller med henblik på måling af cytosolic calcium niveauer og celle skade. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.

Protocol

1.. Forberedelse Pancreas acinarceller for Calcium Imaging Forbered HEPES inkubationspuffer indeholdende 20 mM HEPES, 95 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 0,6 mM MgCl2, 1,3 mM CaCl2, 10 mM glucose, 2 mM glutamin og 1 × mindste Eagles medium ikke-essentielle aminosyrer. Juster den endelige opløsning til pH 7,4 med NaOH. Forbered en BSA inkubationspuffer ved tilsætning BSA (1% vægt / volumen endelig) til 25 ml af HEPES inkubationsbuffer (beskrevet ovenfor). Forbered en collagena…

Representative Results

Et eksempel på acinar celle calcium målinger i respons på fysiologiske stimuli er tilvejebragt i figur 3.. Acinuscellerne blev fyldt med calcium farvestof Fluo-4 og perfunderet med acetylcholin analog carbachol (CCh, 1 uM)) 8. Celler reagerede i form af et calcium-bølge, som initierer i den apikale region og forplanter til den basolaterale region 3,9. Repræsentative kurver er vist i figur 3B viser den typiske top-plateau mønster almindeligvis observeret med 1…

Discussion

Cellen isolation metode og de efterfølgende analyser afbildet her, udgør stærke redskaber til at studere de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i eksokrine pancreas. Fremgangsmåden til isolering dispergerede pancreas acinarceller blev først beskrevet af Amsterdam og Jamieson i 1972 ^11. De metoder, der præsenteres her, er blevet tilpasset fra nyere isolation beskrevet af Van Acker og kolleger ^12. Selv om disse teknikker er meget reproducerbar og let lært, at der er flere kritiske funk…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110