Wir beschreiben ein reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von Maus Azinuszellen des Pankreas von einer Maus für die Zwecke der Prüfung Azinuszelltumoren Calcium-Signale und zelluläre Schädigung mit physiologisch und pathologisch relevanten Reize. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.
Das Pankreas Azinuszelltumoren ist die wichtigste Parenchymzelle des exokrinen Pankreas und spielt eine führende Rolle bei der Sekretion von Pankreas-Enzyme in den Pankreasgang. Es ist auch der Ort für die Einleitung der Pankreatitis. Hier beschreiben wir, wie Azinuszellen isoliert werden aus ganzen Pankreasgewebe und intrazellulären Calcium-Signale werden gemessen. Darüber hinaus beschreiben wir die Techniken der Transfektion dieser Zellen mit adenoviralen Konstrukte und anschließend Messung der Leckage von Laktat-Dehydrogenase, ein Marker der Zellschädigung, während die Bedingungen Azinuszelltumoren Verletzungen in vitro zu induzieren. Diese Techniken bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Azinuszelltumoren Physiologie und Pathologie zu charakterisieren.
Dynamische Veränderungen in zytosolischen Kalzium sind notwendig sowohl für physiologische und pathologische Azinuszelltumoren Veranstaltungen. Diese unterschiedlichen Effekte von Calcium werden gedacht, um aus unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Muster der Calcium-Signalgebung 1 führen. Zum Beispiel werden Enzym und Sekretion aus der Azinuszelltumoren Calcium Spikes aus einem begrenzten Bereich des apikalen Pol, wo Sekretion erfolgt 2 verbunden. Im Gegensatz dazu ist ein globales Calcium Welle durch intensive nicht-oszillierende Kalzium-Signale verfolgt mit frühen pathologischen Ereignissen, die zu einer akuten Pankreatitis führen 3,4 zugeordnet. Dazu gehören intra-acinar Proteaseaktivierung, reduzierte Enzym-Sekretion und Azinuszelltumoren Verletzungen. Unser Labor verwendet isoliert Pankreasazini diese frühen pathologischen Ereignissen, die Krankheit sowohl in vivo und in vitro 5-7 führen zu studieren. Die Methoden detailliert beschreiben Isolierung von primären Azinuszellen zum Zweck der Messung cytosolic Kalziumspiegel und Zellschäden. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.
Die Zelle Isolierung Verfahren und anschließende Tests hier dargestellten stellen leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die physiologische und pathophysiologische Funktionen des exokrinen Pankreas zu studieren. Das Verfahren zur Isolierung verteilt Azinuszellen des Pankreas wurde erstmals von Amsterdam und Jamieson 1972 11 beschrieben. Die hier vorgestellten Methoden aus neueren Methoden Isolierung von Van Acker und Kollegen 12 beschrieben angepasst wurden. Obwohl diese Techniken gut reproduzierba…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health Grants DK083327 und DK093491 (bis SZH) unterstützt.
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase | Worthington | 4188 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
Deionized water | N/A | N/A | |
18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
Equipment | |||
Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |