Utarbeidelse av acinøse Cells for hensikten med Kalsium Imaging, celleskade Measurements, og adenovirus infeksjon

Summary

Vi beskriver en reproduserbar fremgangsmåte for fremstilling av mus acinøse celler fra en mus med det formål å undersøke acinøse celler kalsium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.

Abstract

Den acinøse celle er den viktigste parenchymal celle av den eksokrine pankreas og spiller en primær rolle i utskillelsen av pankreas enzymer inn i bukspyttkjertelen kanal. Det er også stedet for oppstart av pankreatitt. Her beskriver vi hvordan akinærceller er isolert fra hele bukspyttkjertelen vev og intracellulære kalsium signaler måles. I tillegg, beskriver vi teknikker for å transfektere disse cellene med adenovirus-konstruksjoner, og deretter måling av lekkasje av laktatdehydrogenase, en markør for celleskade, under betingelser som induserer acinøs celleskade in vitro. Disse teknikkene gir et kraftig verktøy for å karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.

Introduction

Dynamiske endringer i cytosolic kalsium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinøse celler hendelser. Disse divergerende virkninger av kalsium er antatt å resultere fra forskjellige romlige og temporale mønstre av kalsium signalisering ^en. For eksempel er enzymet og utskillelse fra cellen acinøs knyttet til kalsium pigger fra et begrenset område av den apikale pol hvor utskillelsen finner sted ^to. I kontrast er en global kalsium bølge etterfulgt av intens ikke-oscillasjon kalsium signaler forbundet med tidlige patologiske hendelser som fører til akutt pankreatitt ^3,4. Disse inkluderer intra-acinar protease aktivering, redusert enzym sekresjon, og acinar celleskade. Laboratoriet benytter isolert pankreatisk acini å studere disse tidlige patologiske hendelser som fører til sykdom både in vivo og in vitro ^5-7. Metodene beskrevet her beskriver isolering av primære akinærceller for det formål å måle cytosolic kalsiumnivå og celle skade. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.

Protocol

En. Forbereder acinøse Cells for Kalsium Imaging Forbered HEPES inkubasjonsbuffer inneholdende 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 x minimum Eagles medium ikke-essensielle aminosyrer. Juster den endelige løsningen til pH 7,4 med NaOH. Tilbered en BSA inkubasjonsbuffer ved tilsetning av BSA (1% w / v final) til 25 ml av HEPES-inkubasjonsbuffer (beskrevet ovenfor). Tilbered en kollagenase fordøyelse buf…

Representative Results

Et eksempel på acinøse celler kalsiummålinger som reaksjon på fysiologiske stimuli er gitt i figur 3.. Akinærceller ble lastet med kalsium dye Fluo-4 og perfused med acetylkolin analog carbachol (CCH, 1 mikrometer)) 8. Celler svarte i form av en kalsium bølge som starter i den apikale regionen og forplanter til basolateral regionen 3,9. Representative tracings vist i Figur 3B viser den typiske topp-platået mønster ofte observert med en mikrometer carbachol….

Discussion

Cellen isolasjon metode og påfølgende analyser avbildet her representerer kraftige verktøy som brukes til å studere fysiologiske og patofysiologiske trekk ved eksokrin pankreas. Metoden for å isolere spredt acinøse celler ble først beskrevet av Amsterdam og Jamieson i 1972 ^11. Metodene som presenteres her har blitt tilpasset fra nyere isolasjon metoder beskrevet av Van Acker og kolleger ^12. Selv om disse teknikkene er meget reproduserbart og lett lært, er det flere viktige funksjoner til hv…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110