Preparación de las células acinares pancreáticas para los fines de Imagen de calcio, Lesiones Medidas Celulares e infección viral

Summary

Se describe un método reproducible de la preparación de las células acinares pancreáticas de ratón de un ratón con el fin de examinar las señales de calcio de células acinares y el daño celular con estímulos fisiológica y patológicamente relevantes. Un método para la infección adenoviral de estas células también se proporciona.

Abstract

La célula acinar pancreática es la principal de células de parénquima del páncreas exocrino y desempeña un papel principal en la secreción de enzimas pancreáticas en el conducto pancreático. También es el sitio para la iniciación de la pancreatitis. A continuación se describe cómo se aíslan las células acinares del tejido pancreático conjunto y señales intracelulares de calcio se miden. Además, se describen las técnicas de transfección de estas células con las construcciones adenovirales, y, posteriormente, la medición de la fuga de lactato deshidrogenasa, un marcador de la lesión de las células, en condiciones que inducen la lesión de las células acinares in vitro. Estas técnicas proporcionan una poderosa herramienta para caracterizar la fisiología y la patología de células acinares.

Introduction

Los cambios dinámicos en el calcio citosólico son necesarios para los eventos de células acinares tanto fisiológicas como patológicas. Estos efectos divergentes de calcio se cree que son el resultado de diferentes patrones espaciales y temporales de calcio de señalización ^1. Por ejemplo, la enzima y la secreción de fluidos a partir de las células acinares están vinculados a los picos de calcio a partir de una región restringida del polo apical donde la secreción tiene lugar ^2. En contraste, una onda de calcio mundial seguido de intensas señales de calcio no oscilatorios se asocia con eventos patológicos tempranos que conducen a la pancreatitis aguda ^3,4. Estos incluyen la activación intra-acinar proteasa, la secreción de enzimas reducida y daño celular acinar. Nuestro laboratorio utiliza acinos pancreáticos aislados para estudiar estos eventos patológicos tempranos que conducen a la enfermedad tanto in vivo como in vitro ^5-7. Los métodos detallados siguientes describen el aislamiento de las células acinares primarias para el propósito de medir CYtosolic los niveles de calcio y el daño celular. Un método para la infección adenoviral de estas células también se proporciona.

Protocol

1. Preparación de las células acinares pancreáticas de Imagen de calcio Preparar HEPES tampón de incubación que contiene 20 mM de HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM de MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, y 1 × aminoácidos no esenciales del medio mínimo de Eagle. Ajustar la solución final a pH 7,4 con NaOH. Preparar un tampón de incubación de BSA mediante la adición de BSA (1% w / v final) a 25 ml de HEPES el tampón de incubación (descr…

Representative Results

Un ejemplo de las mediciones del calcio de células acinares en respuesta a estímulos fisiológicos se proporciona en la Figura 3. Las células acinares se cargaron con el colorante de calcio Fluo-4 y se perfundieron con el análogo de acetilcolina carbacol (CCh; 1 M)) 8. Las células respondieron en la forma de una onda de calcio que se inicia en la región apical y se propaga a la región basolateral 3,9. Trazados representativos se muestran en la Figura 3B mues…

Discussion

El método de aislamiento de células y ensayos posteriores representadas aquí representan poderosas herramientas con las que estudian las características fisiológicas y fisiopatológicas del páncreas exocrino. El método para aislar células acinares pancreáticas dispersos fue descrita por primera vez por Amsterdam y Jamieson en 1972 ^11. Los métodos que aquí se presentan han sido adaptados de los métodos de aislamiento más recientes descritos por Van Acker et al ^12. Aunque estas técnicas…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110