Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması
Summary
Biz fizyolojik ve patolojik ilgili uyaranlara ile asiner hücre kalsiyum sinyalleri ve hücresel hasarı incelemek amacıyla bir fare fare pankreas asiner hücre hazırlama tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.
Abstract
Pankreas asiner hücre ekzokrin pankreasın ana parankimal hücre ve pankreatik kanal içine pankreatik enzimlerin salgılanmasını birincil rol oynar. Ayrıca pankreatit başlatılması için bir sitedir. Burada bütün pankreas dokusu ve hücre içi kalsiyum sinyallerinden asiner hücreler izole nasıl tarif ölçülür. Buna ek olarak, in vitro olarak hücre hasarının neden asinar koşullarında, Adeno yapıları bu hücreleri transfekte etmek, ve daha sonra laktat dehidrojenaz, hücre hasarının işareti olan kaçak ölçme teknikleri tarif eder. Bu teknikler asiner hücre fizyolojisi ve patolojisi karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Sitozolik kalsiyum dinamik değişiklikler fizyolojik hem de patolojik asiner hücre olayları için gereklidir. Kalsiyumun bu farklı etkileri 1 sinyal kalsiyum farklı mekansal ve zamansal desen kaynaklandığı düşünülmektedir. Örneğin, asinar hücreden enzim ve sıvı salgılamadan yerine 2 alır apikal kutbunun bir kısıtlı bölge kalsiyum sivri bağlantılıdır. Buna karşılık, yoğun olmayan salınımlı kalsiyum sinyalleri tarafından izlenen bir küresel dalga kalsiyum akut pankreatit 3,4 yol patolojik erken olayları ile ilişkilidir. Bu içi asiner proteaz aktivasyonu, düşük enzim salgılanmasını ve asiner hücre hasarı içerir. Bizim laboratuvar in vivo ve in vitro 5-7 hem hastalığına yol bu erken patolojik olayları incelemek için izole pankreas acini kullanır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntemler cy ölçmek amacıyla birincil asiner hücrelerin izolasyonu tariftosolic kalsiyum düzeyleri ve hücre hasarı. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre izolasyonu yöntemi ve sonraki deneyleri pankreas fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri incelemek için hangi ile güçlü araçlar temsil burada tasvir. Dağınık pankreas asiner hücreleri izole etmek için yöntemi ilk kez 1972 11 Amsterdam ve Jamieson tarafından tanımlanmıştır. Burada sunulan yöntem Van Acker ve arkadaşları 12 tarafından tarif daha yeni izolasyon yöntemleri uyarlanmıştır. Bu tekniklerin son derece tekrarlanabilir ve kolay öğrenilen olmasına rağmen, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Hibe DK083327 ve DK093491 bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (SZH için) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |
References
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
