Vi beskriver en reproducerbar fremgangsmåde til fremstilling af muse pankreatiske acinarceller fra en mus for at undersøge acinar celle calcium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.
Pancreas acinar celle er den vigtigste parenkyme celle af eksokrine pancreas og spiller en primær rolle i sekretion af pancreas enzymer i pancreas kanalen. Det er også stedet for at indlede pancreatitis. Her beskriver vi, hvordan acinar celler isoleres fra hele pancreas væv og intracellulære calcium signaler måles. Herudover beskriver vi de teknikker transfektion disse celler med adenovirale konstruktioner, og efterfølgende måling af udsivning af lactatdehydrogenase, en markør for celleskade under betingelser der inducerer acinar celleskade in vitro. Disse teknikker giver et kraftfuldt værktøj til at karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.
Dynamiske ændringer i cytosolisk calcium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinar celle begivenheder. Disse forskellige effekter af calcium menes at stamme fra forskellige rumlige og tidslige mønstre af calcium signalering 1. For eksempel enzym og væske sekretion fra acinar celle er knyttet til calcium pigge fra en begrænset område af den apikale pol hvor sekretion finder sted 2.. I modsætning hertil er en global calcium bølge efterfulgt af intense ikke-oscillerende calcium signaler forbundet med tidlige patologiske begivenheder, der fører til akut pancreatitis 3,4. Disse omfatter intra-acinært protease aktivering, reduceret enzym sekretion, og acinar celle skade. Vores laboratorium bruger isoleret pancreas acini at studere disse tidlige patologiske begivenheder, der fører til sygdom både in vivo og in vitro 5-7. De beskrevne metoder her beskrive isolering af primære acinarceller med henblik på måling af cytosolic calcium niveauer og celle skade. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.
Cellen isolation metode og de efterfølgende analyser afbildet her, udgør stærke redskaber til at studere de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i eksokrine pancreas. Fremgangsmåden til isolering dispergerede pancreas acinarceller blev først beskrevet af Amsterdam og Jamieson i 1972 11. De metoder, der præsenteres her, er blevet tilpasset fra nyere isolation beskrevet af Van Acker og kolleger 12. Selv om disse teknikker er meget reproducerbar og let lært, at der er flere kritiske funk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health Grant DK083327 og DK093491 (til SZH).
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase | Worthington | 4188 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
Deionized water | N/A | N/A | |
18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
Equipment | |||
Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |