Analys av riktad virala protein Nanopartiklar levereras till HER2 + tumörer
Summary
Den här artikeln beskrivs de förfaranden för optisk avbildning analys av tumören riktade nanopartiklar, HerDox. I synnerhet är detaljerad användning av multimode avbildningsanordning för detektering tumörmålsökning och bedöma tumör penetration beskrivs här.
Abstract
HER2 + tumör-riktade nanopartiklar, HerDox uppvisar tumör-förmånliga ackumulering och tumör-tillväxt ablation i en djurmodell av HER2 + cancer. HerDox bildas genom icke-kovalent självorganisering av en riktad tumör cellpenetration protein med det kemoterapeutiska medlet, doxorubicin, via en liten nukleinsyra linker. En kombination av elektrofil, interkalation och interaktioner oligomeriserings underlättar självorganisering i runda 10-20 nm partiklar. HerDox uppvisar stabilitet i blod liksom i utökad lagring vid olika temperaturer. Systemisk tillförsel av HerDox i tumör-bärande möss resulterar i tumör-celldöd med några påvisbara negativa effekter på icke-tumörvävnad, inklusive hjärta och lever (som genomgår märkt skada av oriktade doxorubicin). HER2 höjd underlättar målsökning till celler som uttrycker den humana epidermal tillväxtfaktorreceptor, därav tumörer uppvisar förhöjda HER2 nivåer uppvisar högre ackumulering av HerDox jämfört med celler uttrycksjunga lägre nivåer, både in vitro och in vivo. Fluorescensintensitet avbildning i kombination med in situ konfokala och spektralanalys har tillåtit oss att kontrollera in vivo tumörsökande och tumörceller penetration av HerDox efter systemisk tillförsel. Här har vi detalj våra metoder för att bedöma tumörmålsökning via multimode avbildning efter systemisk tillförsel.
Introduction
Tumörsökande av kemoterapi har potential att eliminera cancerceller vid lägre dos jämfört med oriktade droger eftersom flera av de levererade terapi kan ansamlas vid sin destination istället dela ut till icke-tumörvävnad. Eftersom den senare situationen skulle späda ut effekten av läkemedlet och därmed kräva högre doser för att vara effektiva, har tumörsökande både terapeutiska och säkerhet fördelar jämfört med vanliga icke-riktad behandling.
Targeting kemoterapi genom inkapsling i egna sammansatta nanopartiklar låter drogen förbli kemiskt oförändrad i motsats till läkemedel som är kovalent kopplade till målsökande molekyler. Som sådan koppling har potential att förändra aktiviteten av både läkemedlet och den målsökande molekylen, icke-kovalent montering tillåter läkemedelspotens ska behållas.
Vi har tidigare visat att den nya tre-komponent, egna sammansatta komplex, HerDox, mål HER2 + tumörer <em> In vivo och framkallar tumör-tillväxt ablation utan att skada normal vävnad, inklusive hjärta 1. HerDox bildas genom icke-kovalenta interaktioner mellan receptorbindande cell-penetration protein, HerPBK10, och det kemoterapeutiska medlet, doxorubicin (Dox), via en liten nukleinsyra linker. HerPBK10 binder den humana epidermal tillväxtfaktorreceptor (HER) och utlöser receptormedierad endocytos 2-4, medan endosomala membranet penetrering sker genom inkorporering av adenovirus härlett-penton base kapsidprotein 4-6. En positivt laddad domän på proteinet möjliggör nukleinsyrabindning 4, 5, genom vilka DNA-intercalated Dox kan transporteras för målinriktad leverans. Elektrofil, inskjutning, och eventuellt protein oligomeriseringsdomäner interaktioner underlättar självorganisering i runda 10-20 nm partiklar som är stabila i blodet och under långvarig förvaring vid olika temperaturer 1. Företrädesrätt inriktning till HER2 + tumörceller underlättas av den förstärkta ligandaffinitet när HER2 är förhöjd.
Våra tidigare studier har visat att systemisk tillförsel av HerDox utbyten företrädesrätt ackumulering i tumörer gentemot icke-tumörvävnad och i jämförelse med oriktade Dox 1, och penetration in i tumörceller in vivo 7. Vi har observerat att HerDox släpper Dox efter tumörcell inträde, så att Dox ackumulering in i kärnan 1. Tumör-ackumulering tycks korrelera med receptor nivå, som relativt låg HER2-uttryckande tumörer ackumuleras mindre HerDox jämfört med dem med jämförelsevis högre HER2 nivå 1. Dessutom uppvisar den effektiva celldöd koncentration ett omvänt samband med HER2 display på tumör cellinjer som uttrycker olika cellytan HER2 nivå 1. HerDox uppvisar en terapeutisk och säkerhet fördel över oriktade Dox, som tumör dödandet sker vid mer än 10 gånger lägre dos jämfört med untartade läkemedel och ger ingen påvisbar negativ effekt på hjärtat (upptäcks med ekokardiografi och histologiska fläckar) eller levern (detekteras av TUNEL fläcken) vävnad, i motsats till oriktade Dox 1. Trots dess härledning från ett viralt kapsidprotein, uppvisar HerPBK10 ingen påvisbar immunogenicitet vid terapeutiska nivåer 2. De pre-existerande antikroppar till hela adenovirus kan känna igen HerPBK10, är de oförmögna att förhindra cellbindning 2.
Tumör volym mätt över tiden är en vanlig metod för att bedöma terapeutiska effekten av riktad terapi, och har varit anställd för att bedöma den terapeutiska effekten av HerDox. Komplettera denna metod med in vivo och ex vivo fluorescensintensitet avbildning har gett oss möjlighet att bättre bedöma inriktning effektivitet 7. Vi har specifikt integrerats in situ konfokal avbildning av utskurna tumörer med spektralanalys av Dox fluorescens för att kontrollera att HerDox ingent ackumulerade endast på tumörer in vivo men trängde in i tumörceller och levererade Dox i cytoplasman och kärnan 7. Spektralanalys aktiveras dessutom oss att skilja Dox fluorescens från autofluorescens 7.
Här kan vi visa mer i detalj vårt tillvägagångssätt för att bedöma HerDox in vivo efter systemisk leverans, och viktigast av allt, för att bedöma målinriktning genom multimode avbildningsmetoder och analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox fluorescens kan detekteras in vivo med hjälp av multimode Imager när tumörer är subkutan. Emellertid är den terapeutiskt effektiva dosen av HerDox (0,004 mg / kg) under detekteringströskeln efter en enda dos. Däremot efter 7 dagliga injektioner (1x/day i 7 dagar), är tumören ackumulering och retention av partikeln tillräcklig för att möjliggöra visualisering av Dox fluorescens.
Det är kritiskt när man arbetar med Dox eller någon annan fluorofor för in vivo-a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag till LKM-K från National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 och R01CA140995). Dr Medina-Kauwe tack C. Rey, M. M-Kauwe och D. Revetto för fortsatt stöd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
References
- Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
- Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
- Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
- Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
- Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
- Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).
- Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).
- Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. . Biomedical Optical Imaging. , (2009).
- Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
- Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).
- Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).
