Analyse de la protéine virale ciblée nanoparticules administrées à HER2 + Tumeurs
Summary
Cet article détaille les procédures d'analyse d'imagerie optique de la nanoparticule tumeur ciblée, Herdox. En particulier, l'utilisation de détail du dispositif d'imagerie multimode pour détecter le ciblage tumoral et l'évaluation de la pénétration tumeur est décrit ici.
Abstract
La nanoparticule HER2 + tumeur-spécifique, Herdox, présente une accumulation de tumeur préférentiel et l'ablation de tumeurs se développer dans un modèle animal de cancer de HER2 +. Herdox est formée par des non-covalente d'auto-assemblage d'une protéine de pénétration cellulaire ciblé tumeur avec l'agent de chimiothérapie, la doxorubicine, par l'intermédiaire d'un petit segment de liaison d'acide nucléique. Une combinaison de électrophile, intercalation, et les interactions d'oligomérisation faciliter l'auto-assemblage en particules rondes 10-20 nm. Herdox présente une stabilité dans le sang, ainsi que dans un stockage prolongé à des températures différentes. Administration systémique de Herdox chez les souris porteuses de tumeurs résultats dans la mort des cellules tumorales, sans effets néfastes décelables à un tissu non tumoral, y compris le cœur et le foie (qui subissent des dommages marquée par la doxorubicine non ciblée). HER2 facilite élévation de ciblage pour des cellules exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique humain, d'où les tumeurs présentant des taux élevés de HER2 présentent une plus grande accumulation de Herdox rapport aux cellules expressionchanter des niveaux inférieurs, à la fois in vitro et in vivo. Imagerie de fluorescence associée à l'analyse spectrale confocale et in situ a permis de vérifier dans la tumeur in vivo ciblage et la pénétration des cellules tumorales de Herdox après l'accouchement systémique. Ici, nous détaillons nos méthodes pour évaluer le ciblage tumoral par l'imagerie multimodale après l'accouchement systémique.
Introduction
Ciblage tumoral de la chimiothérapie a le potentiel d'éliminer les cellules cancéreuses à dose plus faible par rapport aux médicaments non ciblées parce que plus de la thérapie livré peut s'accumuler à sa destination plutôt que de distribuer des tissus non tumoraux. Comme cette dernière situation diluerait sur l'efficacité du médicament et donc nécessiter des doses plus élevées pour être efficace, de ciblage tumoral présente des avantages thérapeutiques et de sécurité par rapport au traitement non ciblée standard.
Cibler la chimiothérapie par encapsulation dans des nanoparticules auto-assemblés permet au médicament de rester sans modification chimique contrairement aux médicaments qui sont liés de manière covalente à des molécules de ciblage. Comme tel lien a le potentiel de modifier l'activité à la fois la drogue et la molécule de ciblage, l'assemblage non covalente permet la puissance du médicament doit être conservé.
Nous avons précédemment montré que le roman à trois composants, complexe auto-assemblée, Herdox, cible HER2 + tumeurs <em> In vivo et suscite l'ablation de tumeurs croissance tout en épargnant les tissus normaux, y compris le cœur 1. Herdox est formé par des interactions non covalentes entre la protéine de liaison au récepteur cellulaire pénétration, HerPBK10, et l'agent de chimiothérapie, la doxorubicine (Dox), par l'intermédiaire d'un petit segment de liaison d'acide nucléique. HerPBK10 se lie au récepteur du facteur de croissance épidermique humain (HER) et déclenche l'endocytose médiée par un récepteur 4.2, alors que la pénétration de la membrane de l'endosome est accompli grâce à l'incorporation de l'adénovirus-base du penton dérivé protéine de capside 4-6. Un domaine chargé positivement sur de la protéine permet d'acide nucléique de liaison 4, 5, par lequel l'ADN-Dox intercalaire peut être transportée pour l'administration ciblée. Électrophile, l'intercalation, et, éventuellement, des interactions d'oligomérisation des protéines de faciliter l'auto-assemblage en particules rondes de 10 à 20 nm qui sont stables dans le sang et en cas de stockage prolongé à des températures différentes 1. Préférentiel visant à HER2 + cellules tumorales est facilitée par le renforcement affinité du ligand lorsque HER2 est élevé.
Nos études antérieures ont montré que l'administration systémique de rendements Herdox accumulation préférentielle dans les tumeurs de plus de tissu non tumoral et par rapport aux non ciblés Dox 1, et la pénétration dans les cellules tumorales in vivo 7. Nous avons observé que les rejets Herdox Dox après l'entrée des cellules tumorales, permettant l'accumulation Dox dans le noyau 1. Tumeur accumulation semble être en corrélation avec le niveau du récepteur, comme relativement faibles tumeurs HER2-exprimant accumulent moins Herdox par rapport à ceux ayant des niveaux relativement élevés de HER2 1. En outre, la concentration de la mort cellulaire efficace présente une corrélation inverse avec HER2 affichage sur des lignées cellulaires tumorales exprimant la surface des cellules différentes HER2 niveaux 1. Herdox présente un avantage thérapeutique et la sécurité sur Dox non ciblé, que l'homicide tumeur survient au cours dose 10 fois inférieure par rapport à la untarstances visées médicament et ne donne aucun effet négatif détectable sur le cœur (détectée par échocardiographie et histologiques tache) ou le foie (détectée par TUNEL tache) tissus, contrairement aux non ciblée Dox 1. En dépit de sa dérivation à partir d'une protéine de capside virale, HerPBK10 présente aucune immunogénicité décelable à des niveaux thérapeutiques 2. Tandis que les anticorps pré-existants à l'ensemble de l'adénovirus peuvent reconnaître HerPBK10, ils sont incapables d'empêcher la liaison cellulaire 2.
Volume tumoral mesuré au fil du temps est une méthode standard d'évaluation de l'efficacité thérapeutique des thérapies ciblées, et a été utilisée pour évaluer l'efficacité thérapeutique de Herdox. Complétant cette approche avec imagerie in vivo et ex vivo de l'intensité de fluorescence nous a permis de mieux évaluer l'efficacité du ciblage 7. Nous avons spécifiquement intégré dans l'imagerie confocale in situ des tumeurs excisées avec l'analyse spectrale de Dox fluorescence pour vérifier que Herdox past seulement accumulé à des tumeurs in vivo, mais pénètre dans les cellules tumorales et Dox livré dans le cytoplasme et le noyau 7. L'analyse spectrale de plus nous a permis de distinguer Dox fluorescence de autofluorescence 7.
Ici, nous démontrons plus en détail notre approche pour évaluer Herdox in vivo après administration systémique, et surtout, pour évaluer le ciblage par des méthodes et des analyses d'imagerie multimodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox fluorescence peut être détectable in vivo en utilisant l'imageur multimode lorsque les tumeurs sont sous-cutanée. Cependant, la dose thérapeutiquement efficace d'Herdox (0,004 mg / kg) est inférieur au seuil de détection après une seule dose. En revanche, après 7 injections quotidiennes (1x/jour pendant 7 jours), l'accumulation tumorale et la rétention de la particule est suffisante pour permettre la visualisation de Dox fluorescence.
Il est essentiel quand …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions à LKM-K de la National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 et R01CA140995) national. Dr Medina-Kauwe remercie C. Rey, M. M-Kauwe et D. Revetto d'un soutien continu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
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