Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em> Ex vivo</em> İnsan Plasental Perfüzyon Modeli
Summary
<em> Ex vivo</em> Çift çevrimli insan plasental perfüzyon modeli insan plasenta boyunca ksenobiyotik ve nanopartiküller devri araştırmak için kullanılabilir. Bu video protokol biz ekipman ve plasenta perfüzyon bir başarılı bir şekilde yürütülmesi için gerekli teknikleri anlatıyoruz.
Abstract
Insan plasenta onlarca yıl önce anne ve doğmamış çocuk arasında bir aşılmaz engel olduğu düşünülüyordu. Ancak, talidomid bağlı doğum kusurları ve çok daha sonraki çalışmalar keşfinden sonra tam tersi oldu. Bugün nikotin gibi birçok zararlı ksenobiyotiklerin, eroin, metadon ya da ilaçlar gibi çevresel kirleticiler bu engeli aşmak için tanımlanmıştır. Nanoteknoloji artan kullanımı ile, plasenta ya yanlışlıkla maruz kalma yoluyla ya da kasten potansiyel nanomedical uygulamaları durumunda yeni nanopartiküller temas muhtemeldir. Plasenta en türe özgü memeli organı 1 çünkü Hayvan deneylerinden elde edilen veri insanlara tahmin edilemez. Bu nedenle, Panigel ve arkadaşları tarafından geliştirilen ex vivo çift devir daim insan plasental perfüzyon,. 1.967 2 ve sürekli Schneider ve arkadaşları tarafından modifiye. 1.972 3, mükemmel bir model t olarak hizmet verebilirksenobiyotiklerin veya parçacıkların transferi çalışma o.
Burada, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için insan plasental perfüzyon protokolü ve daha da geliştirilmesi sirkülasyon ex vivo çift odaklanmak.
Plasenta sezaryenle doğum komplikasyonsuz vadeli gebelik annelerin bilgilendirilmiş onam sonra elde edilmiştir. Sağlam bir Kotiledon fetal ve maternal gemiler en az beş saat için kanül ve perfüze edildi. Bir örnek olarak, 80 parçacık boyutları ve çapı 500 nm olan floresan etiketli polistiren partikülleri, maternal devresi eklenmiştir. 80 nm parçacıklar plasenta bariyerini geçtiği ve 500 nm partiküller plasental doku ya da anne devrede muhafaza ise fetusa plasenta üzerinden aktarılır bir madde için mükemmel bir örnek sağlamak mümkün. Ex vivo insan plasental perfüzyon modeli hakkında güvenilir bilgi veren birkaç model biridirakıllı ve klinik ilgili verileri sağlayan önemli bir doku engeli de ksenobiyotiklerin taşıma davranışı.
Introduction
Plasenta oksijen, karbon dioksit, besin ve atık ürünlerin ve anne ve birbirinden ayrılmış büyüyen cenin iki kan devrelerinde tutmak mümkün aynı zamanda değişimi için sorumlu olan karmaşık bir organdır. Buna ek olarak, bağışıklık sistemi tarafından anne çocuğun reddini önler ve gebelik korumak için hormon salgılayan. Hücresel bariyer 4,5 yanal hücre zarları olmayan bir gerçek syncytium eritmek ve formu sitotrofoblastta hücreler tarafından oluşturulmuştur. Tüm plasenta bir fetal villöz ağaç içeren ve plasentanın bir işlevsel birim temsil birkaç kotiledon, düzenleniyor.
Plasenta bariyerini fonksiyonunun çalışma 1960'lı yıllarda talidomid bağlı malformasyonların keşfi ile yoğunlaştı. Bilinen nedenlerden dolayı hamile kadınlar ile translokasyon çalışmaları gerçekleştirilemez. Sonuç olarak, çeşitli alternatif modeller 6,7 geliştirilmiştir </s> kadar. En umut verici ve belki de en klinik ilgili model Panigel ve iş 2,3 tarafından geliştirilen ex vivo insan plasental perfüzyon modelidir.
Birçok kadın bu gebelik 8 sırasında uyuşturucu veya çevresel kirleticiler gibi farklı ksenobiyotikler maruz kalmaktadır. Zaten hamilelik sırasında düzenli olarak uygulanmıştır bazı ilaçlar, in vivo çalışmalarda göbek kordonu kanı o ile anne kan konsantrasyonu karşılaştırılması ile gerçekleştirilebilir. Ancak, genel olarak fetus ve bu maddelerin teratojenik olarak farmakokinetik ve-dinamikleri hakkında sadece sınırlı bilgi vardır.
Eroin kolayca plasenta bariyerini geçtiği ve intrauterin gelişme geriliği, erken doğum ya da spontan abortus 9,10 yol açabilir gibi örneğin afyon. Yani, gebelik sırasında kayıp yoksunluk durumunda metadon ile replasman tedavisi önerilir. Eskiin vivo insan plasental perfüzyon modeli fetal dolaşıma metadon devri teslim 12 sonra hesaplanan kordon kanı-to-anne kan konsantrasyon oranı ile iyi korelasyon önemsiz 11 olduğunu ortaya çıkardı.
Nanoteknoloji, özellikle tıpta büyüyen bir alandır. Yani, doğal olarak ince meydana gelen (çapı <2.5 mikron) ve orman yangınları, volkan patlamalar duman ve çöl toz ultra ince parçacıklar (çapı <0.1 mikron), mühendislik nano maruz kalma (en az bir boyut <0,1 mikron 13 altında ) artmaktadır. Bu mühendislik Nanomalzemelerin toksikolojik potansiyeli hakkında sorular yöneltti. Hiçbir insan tehlike henüz ispat edilebilir olsa da, mühendislik nanopartiküller toksikolojik sonuçlarının 14 yol açan olumsuz biyolojik reaksiyona neden olduğunu gösteren temel deneysel çalışmalar da vardır. Son zamanlarda, bazı çalışmalarda bu prenatal maruz belirttihava kirliliği yenidoğan ve çocuk 15,16 daha yüksek solunum ihtiyaç ve hava yolu inflamasyonu ile bağlantılıdır. Buna ek olarak, küçük nano-tanecikleri, özellikle fetus ya da anne ya da tedavi etmek için ilaç taşıyıcılar olarak kullanılabilir. Bu nedenle, farklı ksenobiyotikler veya nano ve plasenta bariyerini geçtiği için yeteneklerini geniş çalışmalara ihtiyaç olduğu ortaya çıkmaktadır. Mühendislik Nanomalzemelere plasental geçirgenliği ile ilgili mevcut çalışmaların gerçek bir bakış Menezes ve ark özetlenmiştir. 2.011 17 ve Buerki-Thurnherr ve ark. 2.012 7.
Insan plasental perfüzyon modeli sirkülasyon ex vivo çift sorumlu mekanizmalar gibi çeşitli endojen ve eksojen bileşiklerin 3,11,12,18,19 ve plasental ulaşım ve plasentanın diğer işlevleri geniş bir yelpazede eğitim için kontrollü ve güvenilir bir sistem sağlar preeklampsi gibi patolojik durumları geliştirilmesi <> 20-22 sup. Birikimi, efektler ve ksenobiyotiklerin veya nanopartiküller geniş bir dizi translokasyon oranları çalışma izin Bu protokolü biz sette özellikle kadar odaklanmak, taşıma ve yöntemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift sirkülasyon perfüzyon burada gösterdi altında, cevaplanması gereken soru bağlı olarak mümkün birçok deneysel yapılandırmaları vardır. Özellikle açık plasental perfüzyonları yaygın kararlı durum konsantrasyonu 3 de ilaç boşluk değerlendirmek için kullanılır. Çevrimli perfüzyon kurulum endojen veya eksojen maddelerin aktif nakil teyit etmek için uygulanabilir. Bu yaklaşım için ksenobiyotik ile aynı konsantrasyonu anne ve fetal dolaşıma eklenmelidir. Konsantrasyon deği?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma mali İsviçre Ulusal Vakfı, (NRP 64 programı hiçbir 4.064-131.232 vermek) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
References
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
- Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
- Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
- Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
- Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
- Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
- Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers’ requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
- Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
- von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
- Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
- Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. , (2008).
- Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
- Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
- Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
- Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
- Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
- Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
- Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
- May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
- Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
- Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
- Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
- leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
- athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
- Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
- Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
- Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
- Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
- Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).
