De<em> Ex vivo</em> Dual recirculatie menselijke placenta perfusie model kan worden gebruikt om de overdracht van xenobiotica en nanodeeltjes de humane placenta onderzoeken. In deze video protocol beschrijven we de apparatuur en technieken die nodig zijn voor een succesvolle uitvoering van een placenta perfusie.
Decennia geleden de menselijke placenta werd gedacht aan een ondoordringbare barrière tussen moeder en ongeboren kind. De ontdekking van thalidomide geïnduceerde aangeboren afwijkingen en vele latere studies later bleek het tegenovergestelde. Vandaag verschillende schadelijke lichaamsvreemde stoffen, zoals nicotine, heroïne, methadon of drugs evenals milieuverontreinigende stoffen werden beschreven om deze barrière te overwinnen. Met het toenemende gebruik van nanotechnologie, de placenta waarschijnlijk met nieuwe nanodeeltjes in aanraking te komen, hetzij per ongeluk door blootstelling of opzettelijk in het geval van potentiële nanomedische toepassingen. Gegevens van dierproeven die niet kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens, omdat de placenta is de meest soortspecifieke zoogdieren orgel 1. Daarom is de ex vivo dual recirculerende menselijke placenta perfusie, ontwikkeld door Panigel et al.. In 1967 2 en voortdurend gemodificeerd door Schneider et al.. 1972 3, kan dienen als een uitstekend model to studie van de overdracht van xenobiotica of deeltjes.
Hier richten we ons op de ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie-protocol en de verdere ontwikkeling tot reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
De placenta's werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de moeders van ongecompliceerde zwangerschappen termijn ondergaat keizersnede. De foetale en maternale vaartuigen van een intact zaadlobben werden van een canule en geperfuseerd ten minste vijf uur. Als model fluorescent gelabeld polystyreen deeltjes met grootten van 80 en 500 nm in diameter werd toegevoegd aan de moeder circuit. De 80 nm deeltjes in staat waren om de placenta te passeren en zorgen voor een perfect voorbeeld van een stof die wordt overgedragen via de placenta naar de foetus tijdens de 500 nm deeltjes in de placenta weefsel of moeder circuit werden behouden. De ex vivo menselijke placenta perfusie model is een van de weinige modellen verstrekken van betrouwbare informatie overhet mobiliteitsgedrag van xenobiotica op een belangrijk weefsel barrière die voorspellende en klinisch relevante gegevens levert.
De placenta is een complex orgaan dat verantwoordelijk is voor de uitwisseling van zuurstof, kooldioxide, nutriënten en afvalproducten en tegelijkertijd kunnen de twee circuits bloed van de moeder en de groeiende foetus van elkaar gescheiden te houden. Daarnaast zorgt het ervoor dat de afwijzing van het kind door de moeder immuunsysteem en scheidt hormonen af om zwangerschap te behouden. De cellulaire barrière wordt gevormd door de cytotrofoblastcellen die een getrouw syncytia fuseren en vormen zonder zijdelingse celmembranen 4,5. De gehele placenta bestaat uit verschillende zaadlobben, welke foetale villous boom bevatten en vormen een functionele eenheid van de placenta.
De studie van de placenta functie werd versterkt met de ontdekking van de thalidomide geïnduceerde afwijkingen in de jaren 1960. Om duidelijke redenen translocatie studies met zwangere vrouwen niet kan worden uitgevoerd. Bijgevolg zijn verschillende alternatieve modellen ontwikkeld 6,7 </sup>. De meest veelbelovende en waarschijnlijk meest klinisch relevant model is de ex vivo menselijke placenta perfusie model ontwikkeld door Panigel en medewerkers 2,3.
Veel vrouwen worden blootgesteld aan verschillende xenobiotica zoals drugs of milieuverontreinigende stoffen tijdens hun zwangerschap 8. Voor sommige drugs reeds regelmatig tijdens de zwangerschap kregen toegediend, in vivo kan worden uitgevoerd door vergelijking van de maternale bloedconcentratie met dat navelstrengbloed. Echter, over het algemeen is er slechts beperkte informatie over de farmacokinetiek en-dynamiek in de foetus en de teratogeniciteit van deze stoffen.
Bijvoorbeeld opiaten zoals heroïne gemakkelijk passeren de placenta en kan leiden tot intra-uteriene groeivertraging, vroeggeboorte of een spontane abortus 9,10. Dus, in het geval van ontbrekende onthouding tijdens de zwangerschap een vervangingstherapie met methadon wordt aanbevolen. De exvivo humane placenta perfusie model bleek dat de overdracht van methadon in de foetale bloedsomloop verwaarloosbaar 11, die goed correleert met de berekende navelstrengbloed naar moederbloed concentratieverhouding na levering 12.
Nanotechnologie is een groeiende veld vooral in de geneeskunde. Dus, onder de natuurlijk voorkomende fijne (<2,5 urn in diameter) en ultrafijne deeltjes (<0,1 urn in diameter) in dampen van bosbranden, vulkaanuitbarstingen en desert stof, blootstelling aan synthetische nanomaterialen (tenminste een afmeting <0,1 urn 13 ) toeneemt. Dit riep vragen op over de toxicologische potentieel van technisch vervaardigde nanomaterialen. Hoewel geen mens gevaar nog kon worden bewezen, er zijn belangrijkste experimentele studies waaruit blijkt dat nanodeeltjes schadelijke biologische reacties die leiden tot toxicologische resultaten 14 kunnen veroorzaken. Onlangs heeft een aantal studies gaven aan dat prenatale blootstelling aanluchtverontreiniging wordt gelinkt aan een hogere ademhalings behoefte en luchtwegontsteking bij pasgeborenen en kinderen 15,16. Bovendien kunnen kleine nanodeeltjes worden gebruikt als dragers voor geneesmiddelen specifiek behandelen of de foetus en de moeder. Derhalve wordt duidelijk dat uitgebreide studies van verschillende xenobiotica of nanomaterialen en hun vermogen om de placenta vereist. Een actueel overzicht van de huidige studies over placenta permeabiliteit voor technisch vervaardigde nanomaterialen wordt samengevat in Menezes et al.. 2011 17 en Buerki-Thurnherr et al.. 2012 7.
De ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie model geeft een gecontroleerd en betrouwbaar systeem voor het bestuderen van de placenta transport van verschillende endogene en exogene verbindingen 3,11,12,18,19 en een breed scala aan andere functies van de placenta, zoals mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van pathologische toestanden zoals preëclampsie <sup> 20-22. In dit protocol richten we ons vooral op de set-up, handling en methode die de studie van de accumulatie, effecten en translocatie tarieven van een brede set van xenobiotica of nanodeeltjes toestaan.
Onder de dubbele recirculerende perfusie hier blijkt, zijn er verschillende andere experimentele configuraties mogelijk, afhankelijk van de vraag die moet worden beantwoord. Vooral geopend placenta perfusie worden vaak gebruikt om de klaring te beoordelen bij steady-state concentratie 3. De recirculerende perfusie opstelling kan ook worden toegepast op actief transport van endogene of exogene stoffen bevestigen. Voor deze benadering dezelfde concentratie van de lichaamsvreemde moet worden toegevoegd aan de ma…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt financieel ondersteund door de Zwitserse Nationale Stichting, (NRP 64 programma, verlenen geen 4064-131232).
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
EQUIPMENT | |||
Water bath | VWR | 462-7001 | |
Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
Notebook | Hewlett Packard | ||
Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
Parafilm | VWR | 291-1212 | |
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |