Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em> Ex vivo</em> Modelo perfusión placentaria humana
Summary
La<em> Ex vivo</em> Modelo de perfusión placentaria humana de doble recirculación se puede utilizar para investigar la transferencia de xenobióticos y nanopartículas a través de la placenta humana. En este protocolo de vídeo se describe el equipo y las técnicas requeridas para una ejecución exitosa de una perfusión de la placenta.
Abstract
Hace que la placenta humana Décadas se pensaba que era una barrera impenetrable entre la madre y el niño por nacer. Sin embargo, el descubrimiento de defectos congénitos inducidos por la talidomida y muchos estudios posteriores después demostró lo contrario. Hoy varios xenobióticos perjudiciales como la nicotina, la heroína, la metadona o medicamentos, así como los contaminantes ambientales fueron descritos para superar esta barrera. Con el creciente uso de la nanotecnología, es probable que entre en contacto con nuevas nanopartículas ya sea accidental o intencionalmente a través de la exposición en el caso de posibles aplicaciones nanomédicos la placenta. Los datos de los experimentos con animales no se pueden extrapolar a los seres humanos debido a que la placenta es el órgano específico de la especie de mamífero más 1. Por lo tanto, la ex vivo de doble recirculación de la perfusión placentaria humana, desarrollado por Panigel et al. 2 en 1967 y modificada continuamente por Schneider et al. En 1972 3, puede servir como un modelo excelente to Estudio de la transferencia de xenobióticos o partículas.
Aquí, nos centramos en la doble ex vivo recirculación protocolo de perfusión placentaria humana y su desarrollo para adquirir resultados reproducibles.
La placenta se obtuvieron después de consentimiento informado de las madres de embarazos sin complicaciones término, sometidas a cesárea. Los vasos fetales y maternos de una cotiledones intactos se canularon y perfundidos por lo menos durante cinco horas. Como modelo de partículas se añaden partículas de poliestireno etiqueta fluorescente con tamaños de 80 y 500 nm de diámetro para el circuito maternal. Las partículas de 80 nm eran capaces de cruzar la barrera placentaria y proporcionar un ejemplo perfecto para una sustancia que se transfiere a través de la placenta hasta el feto, mientras que las partículas de 500 nm fueron retenidos en el tejido de la placenta o el circuito materna. El modelo de la perfusión placentaria humana ex vivo es uno de los pocos modelos que proporcionan información fiable sobreel comportamiento de transporte de xenobióticos en una barrera de tejido importante que entrega datos predictivos y clínicos pertinentes.
Introduction
La placenta es un órgano complejo que es responsable para el intercambio de oxígeno, dióxido de carbono, nutrientes y productos de desecho y, al mismo tiempo capaz de mantener los dos circuitos de la sangre de la madre y el feto en crecimiento separados el uno del otro. Además, se previene el rechazo del niño por el sistema inmune materna y secreta las hormonas para mantener el embarazo. La barrera celular está formada por las células citotrofoblastos que se fusionan y forman un verdadero sincitio sin membranas celulares laterales 4,5. Toda la placenta está organizada en varios cotiledones, que contienen un árbol velloso fetal y representan una unidad funcional de la placenta.
El estudio de la función de barrera de la placenta se intensificó con el descubrimiento de las malformaciones inducidas por la talidomida en la década de 1960. Por razones obvias, los estudios de translocación con las mujeres embarazadas no pueden realizarse. En consecuencia, varios modelos alternativos han sido desarrollados 6,7 </sa>. El modelo relevante más prometedor y probablemente más clínica es el modelo de perfusión ex vivo de placenta humana desarrollado por Panigel y compañeros de trabajo 2,3.
Muchas mujeres están expuestas a diferentes xenobióticos como las drogas o los contaminantes ambientales durante el embarazo 8. Para algunos medicamentos que ya se les administró regularmente durante el embarazo, en los estudios in vivo se puede realizar por comparación de la concentración en sangre materna con el que, en la sangre del cordón umbilical. Sin embargo, por lo general sólo hay información limitada sobre la farmacocinética y-dinámica en el feto y la teratogenicidad de estas sustancias.
Por ejemplo los opiáceos como la heroína atraviesa fácilmente la barrera placentaria y puede conducir a la restricción del crecimiento intrauterino, parto prematuro o aborto espontáneo 9,10. Por lo tanto, en caso de falta de abstinencia durante el embarazo se recomienda una terapia de reemplazo con la metadona. El exmodelo de perfusión placentaria humana in vivo reveló que la transferencia de la metadona en la circulación fetal es insignificante 11, que se correlaciona bien con la sangre-a-materna relación de concentración calculada de sangre de cordón después de la entrega 12.
La nanotecnología es un campo cada vez mayor, especialmente en medicina. Así, bajo la forma natural fino (<2,5 m de diámetro) y las partículas ultrafinas (<0,1 m de diámetro) en los humos de los incendios forestales, erupciones volcánicas y polvo del desierto, la exposición a nanomateriales artificiales (al menos una dimensión <0,1 micras 13 ) es cada vez mayor. Esto plantea preguntas sobre el potencial toxicológico de los nanomateriales artificiales. Aunque no hay peligro humana pudo comprobar, sin embargo, hay estudios experimentales principales que indican que las nanopartículas artificiales pueden causar reacciones biológicas adversas que conducen a resultados toxicológicos 14. Recientemente, algunos estudios indican que la exposición prenatal a lala contaminación del aire está ligada a una necesidad respiratoria superior y la inflamación de las vías en los recién nacidos y los niños 15,16. Además, pequeñas nanopartículas pueden ser utilizados como portadores de fármacos para tratar específicamente ya sea el feto o la madre. Por lo tanto, se hace evidente que se requieren extensos estudios de xenobióticos o nanomateriales distintos y su capacidad para cruzar la barrera placentaria. Una visión actual de los estudios actuales sobre la permeabilidad de la placenta a los nanomateriales artificiales se resume en Menezes et al. 2011 17 y Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.
El doble ex vivo de recirculación modelo de perfusión placentaria humana proporciona un sistema controlado y fiable para el estudio del transporte placentario de diversos compuestos endógenos y exógenos 3,11,12,18,19 y una amplia gama de otras funciones de la placenta como mecanismos responsables de la desarrollo de estados patológicos como preeclampsia <sup> 20-22. En este protocolo nos centramos principalmente en la puesta a punto, el manejo y el método que permite el estudio de la acumulación, los efectos y las tasas de translocación de un conjunto amplio de xenobióticos o nanopartículas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debajo de la perfusión recirculante dual mostró aquí, hay varias otras configuraciones experimentales posibles dependiendo de la pregunta que hay que responder. Perfusiones placentarios Particularmente abiertos se utilizan comúnmente para evaluar el aclaramiento del fármaco a una concentración de estado estacionario 3. La perfusión recirculante de configuración se puede aplicar también para confirmar transporte activo de sustancias endógenas o exógenas. Para este enfoque, la misma concentración de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por la Fundación Nacional de Suiza, (NRP programa 64, podrán conceder 4.064 a 131.232).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
References
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