호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근
Summary
이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.
Abstract
상당한 노력은 대규모의 종합 단백질 – 단백질 상호 작용 네트워크의지도를 생성하기 위해 모였다. 이 병원체 호스트 관계를 이해하는 수단이며, 본질적으로 효모 두 하이브리드 시스템을 유전 검사에 의해 수행되었다. Gaussia 루시 페라 기반의 파편 보완 분석에 의한 단백질 – 단백질 상호 작용 검출의 최근 개선은 이제 엄격 세포 요소의 공통 집합에 대해 서로 다른 병원체 변형 변종 단백질의 상호 작용 프로파일을 비교하기 위해 필요한 통합 비교 interactomic 방법을 개발하는 기회를 제공합니다.
이 논문은 특히 단백질 – 단백질 상호 작용 데이터 세트를 생성하는 두 개의 직교 방법을 결합하는 유틸리티에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 (Y2H)과 새로운 분석, 포유 동물 세포에서 수행 높은 처리량 Gaussia 프린 단백질 보완 분석 (HT-GPCA).
NT는 "병원체 단백질의 세포 파트너>의 대규모 식별은 여러 병원체 변형 변형을 사용하여 cDNA를 라이브러리의 두 하이브리드 상영 짝짓기 기반 효모에 의해 수행됩니다. 높은 신뢰도 통계 득점에서 선택한 상호 작용하는 파트너의 하위 집합이 더 있습니다 HT-GPCA을 사용 병원균의 변종 단백질의 전체 세트와 짝 상호 작용 포유 동물 세포에 확인. 두 개의 보완적인 방법이 조합은 상호 작용 데이터 집합의 견고성을 향상하고, 엄격한 비교의 상호 작용 분석의 성능을 할 수 있습니다. 이러한 비교 interactomics은 해독하는 병원체 호스트 interplays에 신뢰할 수있는 강력한 전략을 구성합니다.Introduction
단백질 – 단백질 상호 작용지도를 생성하기 위해 수집 된 데이터의 양이 증가 더욱 병원체 감염을 이해하는 관점을 엽니 다. 병원균 감염의 글로벌 이해가 등장하기 시작, 그것은 인간 프로테옴 1 연결할 때 병원균의 단백질에 의해 유도 교란의 범위에 대한 액세스를 제공합니다. 그것은 따라서 병원균이 숙주 세포의 기계를 조작하는 방법을 이해하는 방법을 제공합니다. 특히, 여러 가지 바이러스 호스트 상호 작용 네트워크의 매핑은 바이러스 성 단백질이 우선적으로 고 (허브) 셀룰러 네트워크에 연결되어 있거나 네트워크 (병목 단백질) 2-4 여러 경로의 중심되는 호스트 단백질을 표적으로 나타났습니다. 이러한 상호 작용은 전염성 자손을 복제하고 생산 수단이되는 바이러스는 중요한 세포 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 비교 상호 작용을 매핑은 최근을 기준으로 정보를 추출하는 것을 목표로 관련 바이러스에 실시되었다발병 4. 또한, 호스트 병원체 상호 작용 풍경의 연구는 많은 병원체 5 확장되었습니다. 대상 셀 요인 식별 세포를 감염하는 병원체에 의해 사용되는 전략에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적 인 병원성 마커를 감지 할 수 있습니다.
효모 두 하이브리드 시스템은 유전자 검사는 단백질 – 단백질 상호 작용의 높은 처리량 매핑을위한 효율적이고 중요한 도구이기 때문에 바이너리 상호 작용을 확인하는 가장 인기있는 방법입니다. 접근 방식은 더함으로써 병원체 호스트 단백질 – 단백질 상호 작용의 비교 개요에 대한 액세스를 제공, 여러 병원균 변형 변형 단백질을 평가하여 개별 Y2H 검진을 향상 여기에 제안했다. 그것은 전체의 상호 작용 6의 약 20 %를 복구 있기 때문에 또한, 효모 두 하이브리드 심사의 주요 제한은, 높은 위음성 율에 자리 잡고 있습니다. 이 병리의 부분 집합만을 감지하는 상호 작용을 의미씨족의 변형은 다른 사람과 감지를 탈출 할 수도 있습니다. 따라서 모든 두 하이브리드 검진에서 나오는 각각의 파트너는 더욱 비교 상호 작용 데이터 세트를 제공하는 연구 균주의 전체 범위의 상호 작용을 위해 도전하고 있습니다. 그것은 다른 방법을 결합하여 강력하게 단백질 – 단백질 상호 작용 데이터 세트 7의 견고성을 증가한다는 것을 증명 되었기 때문에,이 검증은 HT-GPCA 8이라는 새로 개발 된 단백질 조각 보완 분석하여 포유 동물 세포에서 수행됩니다. 이 셀 기반 시스템은 Gaussia 프린의 보완에 의한 단백질 상호 작용의 검출 루시 페라 제를 분할하고 높은 처리량 형식과 호환되도록 설계되었습니다 수 있습니다. 의 발광 기반 기술에 대한 감사의 낮은 배경 소음이 다른 형광 기반의 분석과 비교, HT-GPCA이 현저하게 높은 감도를 보여줍니다.
전반적으로,이 방법은 효율적 구성납치 숙주 세포의 세계 이해를 향한 첫 단계를 나타냅니다 호스트 병원체의 interplays의 포괄적 인 매핑을 생성하는 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
독립적으로, 효모 이러한 두 GST 풀다운 Lumier의 또는 MAPPIT으로 하이브리드 및 포유류의 상호 작용 분석은 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 효과적인 도구로 입증했지만, 양성과 거짓 음성의 높은 속도에 의해 제한됩니다 상호 작용은 이러한 기술 15과 관련된. 또한, 증거가 직교 방법을 결합하여 얻어진 상호 작용 데이터 세트 7의 신뢰성을 증가 시킨다는 성장하고있다. HT-GPCA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 파스퇴르 연구소의 자금 의해 리그 국립 contre 르 암 (보조금 R05/75-129 및 RS07/75-75), 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암 (/ 부여 ARC A09에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 오천삼십일분의 일 및 4867) 및 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR07 MIME 009 02과 ANR09 풍채 026 01). MM은 MENRT의 교제받는 사람이었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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