마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em> 자궁 내</em> 일렉트로
Summary
시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도 불구하고,<em> 자궁 내</em개발의> 유전자 조작은 거의 시도되지 않았습니다. 우리는 당신을위한 자세한 절차를 보여<em> 자궁 내</em마우스 시상 하부 총과 부분 (지역) 시상 하부 형질의 쇼 대표적인 결과로> 일렉트로.
Abstract
개발 포유류 뇌의 특정 영역의 유전자 변형은 매우 강력한 실험적인 방법입니다. 그러나 새로운 마우스 돌연변이를 생성하는 것은 종종 절망적 느립니다. 그것은 합리적인 포스트 치료실 생존 자궁에서 발전 마우스 뇌에 액세스 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 하지만이 절차의 결과가 두뇌 개발의 가장 피상적 쉽게 접근 할 부분에 거의 독점적으로보고되었습니다 피질 즉. 시상, 좁은보다 중간 지역은, 대상에 대한 더 어려운 입증되었습니다. 특히 깊은 핵, 시상 하부의 사람들로 형질은 가장 도전하기 때문에 거의 결과가보고되었다 아마도. 여기에서 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 electroporation을 통해 형질 전환을위한 그것의 일부를 (시상 하부 지역) 대상으로하는 절차를 보여줍니다. 우리의 접근에 키는 t의 긴 마취 시간, 주입하다HIRD 뇌실, 적절한 종류와 전극의 위치. 또한, 우리는 대상과 가장 오목한 시상 하부 핵, mammillary 몸의 후속 조직 학적 분석 결과를 보여줍니다.
Introduction
배아 마우스 뇌의 유전자 조작은 개발 규제에 대해 배울 수있는 바람직한 방법입니다. 돌연변이 마우스 라인의 세대는 그러나 느리고 비싸다. 포유류의 뇌의 뉴런을 개발 특정 유전자 변화를 소개하는 하나의 강력한 방법은 자궁의 electroporation에 있습니다. 기본적으로, 기술은 그 배아는 일정 시간 동안 생존 뇌를 수집하고 가능한 한 소설, 정보 표현형을 위해 그 (것)들을 검사 할 수있는 전기 펄스에 의해 배아 뇌 neuroepithelium에 DNA를 형질로 구성되어 있습니다. 이러한 방법으로, 실험 마우스 돌연변이의 생산에 필요한 긴 대기 기간없이 즉시 가설을 테스트 할 수 있습니다.
개발 배아에 DNA의 형질 전환 병아리 배아 1 비켜 electroporation을에 시작했다. 마우스 증명 (proof-of-concept) 필수는 문화에 수행 된 <s2>까지. 이것은 곧 자궁 3,4에서 마우스 기술의 첫 번째 설명으로 이어졌습니다.
주요 문제는 그 (것)들 또는 어머니를 죽이지 않고 자궁에서 개발 태아의 두뇌를 형질하는 것입니다. (개복술, 사출, 일렉트로) 필요한 수술을 배우는 것은 긴 훈련 기간이 필요합니다. 수술은 태아의 생존 비율이 허용되는 지점을 마스터하고 나면, 그 다음 중요한 질문은 뇌 구조에 액세스 할 수있는? 당연히 자궁의 electroporation에서 얻은 결과를 보여주는 첫 번째 발표 논문 대뇌 피질의 개발 5-9에 집중했다. 수술에 가장 접근 개발에 마우스 뇌의 영역은 피질 (그림 1)이기 때문에 이것은이 기술을 사용하여 출판물의 대부분을 여전히 사실이다. 피질에 자궁의 electroporation에 대한 절차는 설명했습니다인쇄 10 비디오 11~14인치 기술의 수정은 telencephalon의 복부 부분 기저 신경절 15를 대상으로 할 수 있습니다.
telencephalon 이상, 간뇌는 (고전 시상과 시상 하부로 분할)에 도달하기 어려운 전뇌의 영역이다. 그 지느러미와 가장 접근 부분 시상 16-19의 대상 논문 보고서의 작은 숫자입니다.
시상 하부, 전뇌의 대부분의 복부 부분 때문에 하나의 지느러미 표면 (피질) (그림 1) 가장 깊이 지역화. 이 지역은 유전자 자궁에서 마우스 뇌를 조작하기 위해 최선을 다하고 연구자를위한 어려운 과제로 남아. 우리의 지식에, 극소수의 기사는 마우스의 시상 하부 20,21으로 자궁 형질에서의 결과를보고합니다. 그러나 시상 하부 canno의 기능적 중요성그것은, 짝짓기, 번식 및 양육 22 먹고 마시는 같은 행동을 조절 때문에 t은 아무리 강조해도 지나치지. 또한, 시상 하부 개발의 변경은 나중에 비만, 고혈압, 당뇨병 및 조숙 한 사춘기 23과 같은 생활 조건의 발생에 기여한다. 개발하는 동안 유전자 시상 하부를 변경할 수 있다는 것은 이해하기 위해 매우 강력한 도구를 제공 할 것입니다.
우리가 사용하는 임신 한 쥐의 개복 수술에 대한 기본적인 수술 프로토콜은 다른 프로토콜 11,13,14,24에서 사용하는 것과 비슷합니다. 우리는 완전성에 대해 간략히을 설명합니다. 우리의 절차의 핵심, 다른 한편으로는, 마취의 종류, 주입 위치, 전극의 종류와 삽입 및 태아의 머리에 대하여 긍정적 인 전극의 위치입니다. 전자는 대한 수 있기 때문에 우리는 간단한 복강 내 마취를 통해 가스 흡입 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호마취의 다소 긴 기간은 어려운 수술이 필요합니다. 마취에서 빨리 회복 isoflurane을 흡입 결과, 일반적으로 어머니가 이미 수술 후 분 정상 동작을 보여줍니다 때문이다. 유리 micropipette를 가진 DNA 용액의 주입 쉬운 점은 그러나 시상 하부 electroporation을 위해 완전하게 적합하지 않은 측면 뇌실입니다. 직접 뇌실에 주입 참으로 깊은 diencephalic 구조를 대상으로 중요합니다. 이것은 표준, off-the-shelf 전극 E12.0 또는 E12.5에서 시상 하부 형질 할 수 있습니다. 우리는 특히이 목적에 적합 NEPA 유전자 (치바, 일본)에 의해 제조 된 전극의 일부를 발견했다.
우리의 절차를 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 전극 방향에 따라 부분, 지역 형질의 형질을 구하십시오. 여기에서 우리는 틀림없이, mammillary 몸 형질하여 기술을 보여깊은 모든 시상 하부 핵의 가장 오목한. 또한, 우리는 해상도 세포 수준에 형질 전환 세포의 자세한 조직 학적 분석을 보여줍니다.
자궁에서 마우스 두뇌 개발을 형질에 대한 다른 접근 방법 자궁의 electroporation에서의 비교 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마취 소개 : 시상 하부에 자궁의 electroporation 기술적으로 험난 할과 긴 마취 시간을 필요로 할 수 있기 때문에, 우리는 산소와 isoflurane을의 혼합물의 관리를 통해 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호합니다. 우리의 경험에서, 동물, 적어도 어머니의 회복이 매우 빠르고, 배아 생존율이 향상 1 시간까지의 기간 동안이 방법으로 적절한 마취 남아있을 수 있습니다. 마취 다른 방법도 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독일 연구 재단 (도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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