כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים
Summary
הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.
Abstract
כדי לחקור את האינטראקציה שומנים החלבון באופן מצמצם, יש צורך לשלב את החלבונים בממברנה לקרומים של הרכב שומנים מוגדר היטב. אנו לומדים את השפעות gating שומנים בדם תלויות באשלגן ערוץ מתח מגודרת אב טיפוס (KV), ועבדנו את נהלים מפורטים כדי לשקם את הערוצים למערכות שונות בממברנה. הליכי הכינון מחדש שלנו לקחת שיקול של שניהם היתוך המושרה בחומרי ניקוי משלפוחית והאיחוי של מיצלות חלבון / חומר ניקוי עם מיצלות מעורבת שומנים / חומר ניקוי, כמו גם את החשיבות של להגיע לחלוקת שיווי משקל של שומנים בין החלבון / חומר הניקוי / שומנים וחומרי הניקוי מיצלות מעורבת / שומנים בדם. הנתונים שלנו הציעו שההכנסה של הערוצים בשלפוחית השומנים היא אקראית יחסית באורינטציות, ואת יעילות הכינון מחדש היא כל כך גבוהה שאין אגרגטים חלבון גילוי נראו בניסויים חלוקים. יש לנו מנוצלים מחדשערוצי D כדי לקבוע את מצבי קונפורמציה של הערוצים בשומנים שונים, להקליט את הפעילות חשמלית של מספר קטן של ערוצים ששולבו בbilayers שומנים מישוריים, מסך לligands קונפורמציה ספציפי מהפאג-מוצגת ספריית פפטיד, ולתמוך בצמיחה של גבישי 2D מהערוצים בקרום. הכינון מחדש את הנהלים שתוארו כאן עשויים להיות מותאמים ללימוד חלבוני קרום אחרים בbilayers שומנים, במיוחד עבור החקירה של השפעות השומנים על תעלות היונים מתח מגודרת אוקריוטים.
Introduction
חומרי חליפין תאים ומידע עם הסביבה שלהם באמצעות הפונקציות של חלבונים בממברנה ספציפיים 1. חלבוני קרום בקרום תא מתפקדים כמשאבות, תעלות, קולטנים, אנזימים, intramembrane linkers ותומכים מבניים על פני ממברנות. מוטציות המשפיעות על החלבונים בממברנה היו קשורות למחלות בבני אדם רבים. למעשה, חלבונים בממברנה רבים כבר את מטרות התרופה העיקריות כי הם חשובים ונגישים בקלות בקרום תא. לכן זה מאוד חשוב להבין את המבנה והתפקוד של חלבונים בממברנה שונים בקרום, ולהפוך אותו אפשר להמציא שיטות חדשות כדי להקל על ההשפעות מזיקות מהחלבונים שעברו מוטציה במחלות אנושיות.
שומנים להקיף את כל חלבונים בממברנה משולבים ב2 bilayers, 3. בממברנות אוקריוטים, הסוגים השונים של שומנים ידועים להיות מאורגנים microdomains 4, 5.חלבונים בממברנה רבים הוצגו לחלוקה בין microdomains אלה, כמו גם בשלב הנוזל המגושם של 3 קרומים, 6. המנגנון הבסיסי של ארגון microdomains והאספקה של חלבונים בממברנה לתוכם והמשמעות הפיזיולוגית של הפצות כאלה הם חשובים באופן ברור, אך נשאר הבין היטב. קושי טכני גדול באחד לומד את ההשפעות על שומני חלבונים בממברנה הוא הכינון מחדש אמין של יוכימית מטוהר חלבונים בממברנה לקרומים של הרכב שומנים מבוקר היטב, כך שכמעט בכל חלבונים מחדש הם 7 פונקציונליים. בשנים האחרונות, פיתחנו שיטות כדי לשקם את ערוץ אשלגן מתח מגודרת אב הטיפוס מא pernix (KvAP) לתוך מערכות שונות לממברנה 8-10 מחקרים המבניים ותפקודי. את הנתונים מאחרים ואותנו יחד הראו כי השומנים הם סביר הקובע בשינויי קונפורמציה של מתח החישהתחומים של ערוץ יון מתח מגודרת ועשויים לעצב את המבנים של חלק מערוצים אלה 11. בעולם הבא, נספק תיאור מפורט של השיטות שלנו ואציע טיפים טכניים קריטיים שצפויים להבטיח רבייה המוצלחת של התוצאות שלנו, כמו גם הרחבה של השיטות שלנו למחקרים של חלבונים בממברנה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכינון מחדש של ערוצי KvAP לתוך ממברנות שונות כבר בשימוש בכמה מחקרים 8-10. בעקבות הרעיון של הבטחת ההפצה של שומנים בין חומרי ניקוי / שומנים מיצלות המעורבות ואת micelles מעורב החלבון / חומר ניקוי / שומנים בדם, אנו מסוגלים להגיע לכינון מחדש של KvAP כמעט מלא לממברנות עשויות משו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקרים על KvAP במעבדה ג'יאנג קיבלו עזרה משמעותית ממעבדתו של ד"ר רודריק מקינון באוניברסיטת רוקפלר. תודה מיוחדת לד"ר בראון ומייקל Kathlynn McQuire לעצתם ולעזור בניסויי הפאג המסך שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH (GM088745 וGM093271 כדי ש-XJ) וAHA (12IRG9400019 כדי ש-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
