إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية
Summary
يتم وصف إجراءات إعادة كاملة من قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج في الأغشية الدهنية. القنوات المعاد هي مناسبة لفحوصات الكيمياء الحيوية، والتسجيلات الكهربائية، وفحص يجند والدراسات البلورات الإلكترون. قد يكون هذه الأساليب التطبيقات العامة للدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء الأخرى.
Abstract
لدراسة التفاعل دهون، بروتين بطريقة reductionistic، فمن الضروري دمج بروتينات الغشاء في الأغشية من تكوين الدهون واضحة المعالم. نحن ندرس آثار النابضة التي تعتمد على الدهون في البوتاسيوم الجهد بوابات (كيلو فولت) قناة النموذج الأولي، وعملت الإجراءات المفصلة لإعادة تشكيل قنوات في غشاء أنظمة مختلفة. إجراءات إعادة النظر في اتخاذ لدينا على حد سواء الانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات والانصهار من البروتين / المنظفات المذيلات مع دهن / المنظفات المذيلات المختلطة فضلا عن أهمية التوصل إلى توزيع توازن الدهون بين البروتين / المنظفات / الدهون والمنظفات المذيلات المختلطة / الدهون. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن الإدراج من القنوات في حويصلات الدهنية هو عشوائي نسبيا في التوجهات، وكفاءة إعادة مرتفع بحيث لم تظهر أية المجاميع البروتين التي يمكن اكتشافها في التجارب تجزئة. لقد استخدمت إعادةقنوات D لتحديد الدول بتكوين جزئي من القنوات في الدهون المختلفة، وتسجيل الأنشطة الكهربائية من عدد قليل من القنوات إدراجها في طبقات ثنائية الدهون مستو، وشاشة لبروابط التشكل محددة من مكتبة الببتيد عرض-فج، ودعم نمو بلورات 2D من القنوات في الأغشية. يمكن تكييفها إجراءات إعادة الموصوفة هنا لدراسة بروتينات غشاء أخرى في طبقات ثنائية الدهون، وخاصة للتحقيق في آثار الدهون على القنوات الأيونية الجهد بوابات حقيقية النواة.
Introduction
الخلايا تبادل المواد والمعلومات مع بيئتها من خلال وظائف بروتينات غشاء محددة 1. بروتينات الغشاء في أغشية الخلايا تؤدي وظيفة ومضخات، والقنوات، المستقبلات، والإنزيمات intramembrane، ينكرز وأنصار الهيكلي عبر الأغشية. كانت الطفرات التي تؤثر على بروتينات الغشاء ذات الصلة العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. في الواقع، كانت العديد من البروتينات الغشاء الأهداف المخدرات الأولية لأنها مهمة ويمكن الوصول إليها بسهولة في أغشية الخلايا. ولذا فمن المهم جدا لفهم بنية ووظيفة البروتينات الغشاء مختلف في الأغشية، وتجعل من الممكن استنباط أساليب جديدة للتخفيف من الآثار الضارة من البروتينات متحولة في الأمراض التي تصيب الإنسان.
الدهون تحيط بكل بروتينات غشاء متكاملة في طبقات ثنائية 2، 3. في الأغشية حقيقية النواة، من المعروف أن مختلف أنواع مختلفة من الدهون التي سيتم تنظيمها في microdomains 4، 5.وقد أظهرت العديد من البروتينات الغشاء ليتم توزيعها بين هذه microdomains فضلا عن مرحلة السوائل ضخمة من الأغشية 3، 6. الآلية التي يقوم عليها التنظيم من microdomains وتسليم بروتينات الغشاء الى لهم وأهمية الفسيولوجية مثل هذه التوزيعات هي مهمة بوضوح ولكن لا تزال غير مفهومة تماما. إحدى الصعوبات التقنية الرئيسية في دراسة آثار الدهون على بروتينات الغشاء هو إعادة موثوقة من تنقية البروتينات كيميائيا الغشاء في الأغشية التي تسيطر عليها جيدا تركيبة الدهون حتى يتسنى لجميع البروتينات أعادت تقريبا وظيفية 7. في السنوات القليلة الماضية، قمنا بتطوير طرق لإعادة تشكيل قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج الأولي من A. pernix (KvAP) في النظم المختلفة لغشاء الهيكلية والوظيفية دراسات 8-10. وأظهرت بيانات من الآخرين، ولنا معا أن الدهون من المرجح عاملا محددا في التغييرات متعلق بتكوين من الجهد الاستشعارالمجالات من قناة أيون الجهد بوابات وربما تشكيل هياكل بعض من هذه القنوات 11. في القادم، وسوف نقدم وصفا مفصلا لأساليب عملنا وسوف نقدم نصائح تقنية الحرجة التي من المرجح أن ضمان نجاح الاستنساخ من نتائجنا وكذلك تمديد طرقنا على دراسات للبروتينات غشاء الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم إعادة تشكيل قنوات KvAP في الأغشية المختلفة في العديد من الدراسات 8-10. بعد فكرة ضمان توزيع الدهون بين المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة والبروتين / المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة، ونحن قادرون على الوصول إلى إعادة شبه كاملة من KvAP في الأغشية المصنوع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حصل على دراسات في KvAP في المختبر جيانغ مساعدة كبيرة من رودريك ماكينون معمل د. في جامعة روكفلر. شكر خاص إلى الدكتور Kathlynn براون ومايكل McQuire للحصول على المشورة والمساعدة على التجارب بشاشة فج لدينا. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (GM088745 وGM093271 إلى Q-XJ) وAHA (12IRG9400019 إلى Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
